***************CONTENTS基因敲除技术原理简介1基因敲除小鼠的基因型鉴定2基因敲除小鼠的饲养和繁殖3基因敲除技术原理简介一、1.基因敲除技术简介基因敲除小鼠技术(knock-outmousetechnology)是指通过基因工程的方法使小鼠体内某种基因功能缺失的生物学技术。传统的基因敲除方法有：①插入突变法②同源重组法③RNA干扰(RNAinterference,RNAi)法目前在同源重组法的基础上改良的基因敲除技术有：①借助Cre-loxp系统的条件型基因敲除法②CRISPR／Cas9技术（棕褐色AA）（白色）（Aa）（Aa）(AA)(AA)（Aa）（Aa）(aa)2.基因敲除技术步骤2.1胚胎干细胞的分离培养待胚胎周围逐渐形成ES细胞集落。进行一段时间的培养后将ES细胞集落吸出分散成单个的细胞，将这些单细胞分离出来进行常规培养。。（它应该具有正常的二倍体核型及体内外分化能力）鉴定方法①把这种胚胎移植到雌性假孕鼠的子宫内，是否形成“嵌合体”胚胎。②将ES细胞注入到同种或免疫缺陷性小鼠的皮下、睾丸或肾包囊，观察注入的细胞在宿主动物体内是否形成畸胎瘤。③把受试细胞在体外进行随机自发的分化或诱导它们向不同胚层的细胞分化。一般的方法是去除饲养层细胞后，ES细胞聚集并形成类胚体。2.基因敲除技术步骤2.2构建基因打靶载体根据需敲除的基因序列的特点设计的含有2个标记筛选基因和特定基因同源臂序列的靶向载体。以敲除小鼠Fam172a基因为例：靶向载体Fam172a同源序列靶基因2.基因敲除技术步骤2.3同源重组将打靶载体导入129小鼠ES细胞：目前常用的方法有显微注射法和电穿孔法。同源重组筛选：由于哺乳动物细胞中基因随机整合的机率要远大于同源重组，因此需要利用选择性标记基因将发生同源重组的细胞筛选出来，目前常用的筛选方法有正负双向选择法。正负双向选择法neo:正向选择基因。具有新霉素(G418)抗性，其在发生随机组合和同源重组的细胞中都可以表达。HSV-tk：负向选择基因。在发生同源重组时别剪切掉，发生随机组合时被保留。tk基因可使无毒的丙氧鸟苷（GANC）转化为毒性核苷酸而杀死细胞。neo基因保留，tk基因被切除对G418和GANC都有抗性对G418有抗性，对GANC敏感neo、tk基因均被保留靶向载体筛选出中靶ES2.基因敲除技术步骤2.4基因敲除小鼠的产生将中靶的ES细胞注入到BALB/c小鼠囊胚，接种到新的培养皿中进行培养。将正常发育含ES细胞的囊胚移植入受体小鼠子宫内嵌合体小鼠的鉴别：通过观察小鼠被毛的颜色就可确定嵌合体小鼠。基因敲除小鼠的制备：因为在同源重组过程中，ES细胞的2条染色体中一般只有1条进行重组，得到嵌合体小鼠后，还要经过至少2代的繁育过程才能得到基因敲除小鼠。基因敲除小鼠的基因型鉴定二、1.利用PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定1.1提取小鼠尾部DNA组织1.2PCR扩增与琼脂糖凝胶电泳鉴定基因型针对不同的Fam172a+/-，Fam172a-/-，WT设计不同的引物采用PCR仪进行扩增：变性→退火→延伸取PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳根据凝胶成像仪中的条带鉴别基因型可能的结果分析Fam172a+/-出现两条带，Fam172a-/-只出现一条带，WT出现一条带，但Fam172a-/-和WT出现的位置不同。2.利用WB测定组织中FAM172a蛋白水平2.1提取小鼠尾部组织蛋白2.2BCA法检测蛋白浓度2.3WB分析可能出现的结果：WT小鼠的条带灰度最高；Fam172a+/-条带的灰度值其次；Fam172a-/-无条带出现。***************