细胞冻存时，存在两种损伤：冰晶损伤溶质损伤冰晶损伤：由于温度下降，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏并引起细胞死亡。这种因细胞内、外结冰而致的细胞损伤被称为细胞的冰晶损伤。冰晶损伤是由冷却速度过快造成，冷却速度越快，冰晶损伤越大。第30页，共47页，星期日，2025年，2月5日溶质损伤：因保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤被称为溶质损伤。细胞悬浮在溶液中，随着温度的下降，细胞外部的水分会先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质的浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质会受到损坏，细胞便发生渗漏。溶质损伤是由冷却速度过慢，使细胞在高浓度的溶液中暴露的时间过长而造成，冷却速度越慢，此损伤越严重。第31页，共47页，星期日，2025年，2月5日如果在溶液中加入冷冻保护剂时，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。保护机理：冷冻保护剂易同溶液中水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成；通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤，细胞得以在超低温条件下保存。第32页，共47页，星期日，2025年，2月5日影响冷冻效果的因素有以下几点：1.冷冻速率当冷冻速度过慢时，细胞脱水严重，细胞体积严重收缩，超过一定程度时即失去活性。冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶质损伤。当冷冻速度过快时，细胞内水分来不及外渗，会形成较大冰晶,造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内冰晶损伤。2.冷冻保存温度：液氮温度(-196℃)是目前最佳冷冻保存温度。应用-70℃～-80℃条件冷冻保存细胞，短期内对细胞活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显下降。第33页，共47页，星期日，2025年，2月5日4.冷冻保护剂（渗透性非渗透性）：渗透性常用甘油、DMSO渗透到细胞内，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤；同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。甘油和DMSO并不能防止细胞内结冰。在使用该类冷冻保护剂时，需要一定的时间进行预冷。目前，DMSO的应用比甘油更为广泛。第34页，共47页，星期日，2025年，2月5日关于基本常用技术第1页，共47页，星期日，2025年，2月5日第一节无菌技术防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。由于体外培养细胞缺乏抗感染能力，故在一切操作中要努力做到最大限度的无菌。细胞培养工具做到细胞培养专用进出细胞培养室做到更衣换鞋超净工作台紫外照射时不要放置过多物品遮挡紫外线第2页，共47页，星期日，2025年，2月5日一、操作区消毒1.使用紫外线灯灭菌，照射细胞培养室和超净工作台20-30min。2.在用紫外线灯照射期间，超净工作台上放置物品不要过多，留有死角阻碍照射，勿置培养细胞和培养用液等物，以免受射线影响(必要时可用纸张覆盖)。3.所有操作用具（包括培养瓶）要经75%的乙醇擦拭后才可放置进超净工作台内。4.实验开始前使用75%的乙醇擦拭超净工作台台面。第3页，共47页，星期日，2025年，2月5日二、洗手和着装1.进入细胞培养室更换专用室内鞋和无菌服、帽子和手套。2.使用75%酒精或0.2%的新洁尔灭洗手。3.实验过程中可能触及污染物品或者出入培养室均要洗手。第4页，共47页，星期日，2025年，2月5日三、火焰消毒1.在无菌环境进行培养或做其它无菌操作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作,需要在酒精灯附近进行。2.实验中使用器械均要经过火焰烧灼进行。3.金属器械不宜灼烧长，防止退火和过热。4.含营养液的吸管不要灼烧防止营养液碳化。5.培养瓶口过火时间不要太长防止烧死细胞。第5页，共47页，星期日，2025年，2月5日四、培养操作1.操作台面布局合理2.不用手触及已消毒物品3.操作保持一定顺序，动作准确敏捷4.组织或细胞在未做处理前或培养液在未用前，勿过早暴露在空气中；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口。5.防止各种用液的交叉污染。6.不向操作方向讲话或咳嗽第6页，共47页，星期日，2025年，2月5日原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。意义:1.原代培养的最大优点是细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，具有二倍体的遗传性，而且大多数细胞表现出原来组织的特性。2.利用原代培养做各种实验，如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。3.原代培养也是建立各种细胞系（株）必须