关于实验一质粒的提取及琼脂糖凝胶电泳第1页，共23页，星期日，2025年，2月5日载体构建过程一、质粒DNA的提取及电泳检测二、目的基因的PCR扩增及产物检测三、DNA的定性定量分析及酶切产物检测质粒双酶切PCR产物双酶切四、酶切产物及PCR产物的纯化及检测五、DNA的连接及检测六、大肠杆菌的培养和超级感受态细胞的制备七、质粒DNA的原核转化和蓝白斑筛选酶切产物+酶切产物T载体+PCR产物第2页，共23页，星期日，2025年，2月5日实验学时：6学时实验类型：综合性 每组人数：4人／组实验一 质粒DNA的提取及
琼脂糖凝胶电泳检测
第3页，共23页，星期日，2025年，2月5日一、实验目的通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的技术和方法。一、碱裂解法小量制备质粒DNA第4页，共23页，星期日，2025年，2月5日质粒按复制方式分为两种类型：松弛型质粒20～200个拷贝/细胞严紧型质粒1～2个拷贝/细胞实验背景
质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在；质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，称为开环DNA；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA。当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。第5页，共23页，星期日，2025年，2月5日由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的MCS处的Xba?I和Sal?I识别位点之间插入了EcoR?V识别位点，用EcoR?V进行酶切反应后，再在两侧的3＇端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有PCR?产物的3＇末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。复制起点筛选标记基因多克隆位点第6页，共23页，星期日，2025年，2月5日二、实验原理
高碱细菌的细胞壁破裂，内容物释放①染色体DNA断裂成不同长度的线性双链DNA；②线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。①质粒DNA不发生断裂，保持双链闭合环状；②双链DNA并不完全分离。高酸中和至中性变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中纯化RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质第7页，共23页，星期日，2025年，2月5日SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性(NaOH)环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。第8页，共23页，星期日，2025年，2月5日三、仪器、材料与试剂(一)仪器1．恒温培养箱2．恒温摇床3．台式离心机4．高压灭菌锅(二)材料1．含连接外源基因质粒的E.coli2．1.5mLEppendorf管3．吸头、微量移液器第9页，共23页，星期日，2025年，2月5日SolutionI50mmol／L葡萄糖25mmol／LTris·HCl(pH8.0)10mmol／LEDTA(三)主要试剂溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl组成(保护、缓冲)葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的机械剪切作用,防止破坏质粒(保护作用)EDTA的作用是络合掉镁等二价金属离子,防止DNA酶对质粒分子的降解作用（保护作用）Tris-HCl使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用）第10页，共23页，星期日，2025年，2月5日SolutionII0.4mol/LNaOH，2％SDS,用前等体积混合溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与NaOH组成(裂解、变性)SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性（裂解细胞和蛋白质变性作用）NaOH（PH12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用）第11页，共23页，星期日，20