关于总RNA的提取电泳鉴定及RTPCR第1页，共31页，星期日，2025年，2月5日实验一.提取小鼠肝脏组织的RNA第2页，共31页，星期日，2025年，2月5日一、真核细胞的总RNA1、mRNA:1-5%5`鸟嘌呤7位甲基化—CH3修饰。1）免受核酸酶破坏，2）起始、促进蛋白质合成。3`poly(A)尾巴结构20--200个A.翻译所必需。起始密码：AUG终止密码：UAA,UAG,UGA。2、tRNA:10-15%3、rRNA:80-85%大亚基60S:28S=4718nt5S=120nt5.8S=160nt小亚基40S:18S=1874nt第3页，共31页，星期日，2025年，2月5日二、RNA提取的注意事项RNA酶：广泛存在：灰尘、人体唾液、实验器材表面。生物活性非常稳定：耐热、耐酸、耐碱。1、尽量避免外源性RNase污染A.操作环境空气洁净。带手套、口罩。B.用新开封的化学试剂。（试剂应该专用）C.一次性塑料器材最好是新开封，(DEPC水处理后）高压灭菌。D.玻璃器材、水都应该经过去RNase处理。对玻璃器材还应该进行高温烘烤。2、抑制内源性RNase活性：RNase抑制剂。RNA分离的关键因素：避免RNA酶的污染。第4页，共31页，星期日，2025年，2月5日1)发放口罩，帽子，每个组来一个人领取。将1mLTrizol试剂移入Eppendorf管中。2)实验教师操作:取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不宜过大,放在玻片上立即研磨,研磨要彻底。3)将研磨后的组织(小米粒大小)转移至1mLTrizol试剂中，盖紧盖，上下颠倒混合2min以上。
使组织细胞充分裂解。肉眼观察可见液体变成均匀浑浊状。4)室温孵育10min。三、RNA提取的实验操作播放有声课件1:RNA提取方法及注意事项第5页，共31页，星期日，2025年，2月5日1、异硫氰酸胍法：GuSCN是一种强的蛋白质变性剂，能够裂解细胞的同时，还能有效地抑制内源性Rnase的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总RNA。特点：需低温操作，但价格经济。2、Trizol试剂（商品化产品）特点：在室温下可以提取细胞总RNA，简单、快速、提取量大、纯度高。3、mRNA提取试剂盒真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚dT纤维素结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出来。RNA提取的几种方法室温孵育10min介绍第6页，共31页，星期日，2025年，2月5日RNase抑制剂1、DEPC(二乙基焦炭酸盐)最常用的RNase抑制剂:与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。有效浓度：0.05%---0.1%(DEPC水)，室温磁力搅拌20分钟。用于浸泡各种器材。灭活条件：高压。在Tris溶液中半衰期为1.25min。试剂的配制:无RNase的溶液(用DEPC水配制,高压)储存方法：不能用聚苯乙烯器皿。4?C，或液氮中。2、肝素：使用浓度：0.1—10mg/ml效果:37?C时，可抑制95%的RNase