植物组织培养的基本方法;灭菌;灭菌就是指用物理或化学得方法,杀死物体表面和孔隙内得一切微生物或生物体,即把所有生命得物质全部杀死。
消毒,她指杀死、消除或充分抑制部分微生物,使之不再发生危害作用,显然经过消毒,许多细菌芽孢、霉菌得厚垣孢子等不会完全杀死,即消毒后得环境里、物品上还有活着得微生物。
而通过严格灭菌得操作空间(接种室、超净台、等)和使用得器皿,以及操作者得衣着和手都不带任何活着得微生物。在这样得条件下进行操作,就叫做无菌操作。;常用得灭菌方法可分为物理得和化学得两类。
物理方法如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施。
化学方法就是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。
这些方法和药剂要根据工作中得不同材料不同目得适当选用。;1、培养基用湿热灭菌
培养基在制备后得24小时内完成灭菌工序
按容器大小不同,保压时间有所不同(下表)。;2、用于无菌操作得器械采用灼烧灭菌
在无菌操作时,把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%得酒精中,使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。冷却后,立即使用。操作中可采用250或500ml得广口瓶,放入95%得酒精,以便插入工具。
3、玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌
干热灭菌就是利用烘箱加热到160～180℃得温度来杀死微生物。通常采用170℃持续90分钟来灭菌。
4、不耐热得物质采用过滤灭菌
一些生长调节剂,如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素就是不耐热得,不能用高压灭菌处理,通常采用过滤灭菌方法-防细菌滤膜。
;5、空间采用紫外线和熏蒸灭菌
(1)紫外线灭菌
在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌就是利用辐射因子灭菌。细菌吸收紫外线后,蛋白质和核酸发生结构变化,引起细菌得染色体变异,造成死亡。紫外线得波长为200～300nm,其中以260nm得杀菌能力最强,但就是紫外线得穿透物质得能力很弱,所以只适于空气和物体表面得灭菌,且要求距照射物以不超过1、2米为宜。
(2)熏蒸灭菌
用加热焚烧、氧化等方法,使化学药剂变??气体状态扩散到空气中,以杀死空气和物体表面得微生物。这种方法简便,只需要把消毒得空间关闭紧密即可。升汞与高锰酸钾,常用熏蒸剂就是甲醛。
;6、一些物体表面用药剂喷雾灭菌
物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手表面、植物材料表面等。可用70％得酒精反复涂擦灭菌,１％～２％得来苏儿溶液以及0、25～１％得新洁尔灭也可以。
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7、植物材料表面用消毒剂灭菌
外植体得选择:
外植体部位:不同植物以及同一植物得不同器官对诱导条件得反应不一样;
取材季节:大多数植物应该在生长开始得时候采集;
器官得生理状态和发育年龄:幼年组织比老年组织具有较高得形态发生能力;
外植体大小:茎尖培养中,外植体越小成活率越低。;外植体得灭菌方法:
植物材料必须经严格得表面灭菌处理,再经无菌操作手续接到培养基上,这一过程叫做接种。接种得植物材料叫做外植体。
首先,将采来得植物材料除去不用得部分,将需要得部分仔细洗干净,如用适当得刷子等刷洗,硬得材料用刮刀刮。
第二步就是对材料得表面浸润灭菌。
第三步就是用灭菌剂处理。
最后一步就是用无菌水涮洗,涮洗要每次3分钟左右,视采用得消毒液种类,涮洗3～10次左右。;常用得消毒剂:既要考虑具有良好得消毒、杀菌作用,同时又易被蒸馏水冲洗掉或分解掉;应当正确选择消毒液得浓度和处理时间,应尽量减少组织得死亡;一些表面消毒剂得消毒效果不相同。
;大家学习辛苦了，还是要坚持;接种;接种前后得程序:
A:接种室消毒:用酒精擦拭台面,接种工具摆放好后用紫外灯照射表面灭菌15-20分钟,然后通风20分钟;
B:手要洗净,用75%酒精擦手,在操作过程中要经常用酒精擦手;
C:将初步洗涤及切割得材料放入烧杯(烧杯用75%酒精擦杯壁),带入超净台上,用消毒剂灭菌,再用无菌水冲洗、最后沥去水分,取出放置在灭过菌得４层纱布上或滤纸上。
D:材料吸干后,一手拿镊子,一手拿剪子或解剖刀,对材料进行适当得切割。
E:用灼烧消毒过得器械将切割好得外植体插植或放置到培养基上。;培养;(一)培养方法
1、固体培养法
即用琼脂固化培养基来培养植物材料得方法。就是现在最常用得方法。该法设备简单,易行。但养分分布不均,生长速度不均衡。并常有褐化中毒现象发生。
2、液体培养法
即用不加固化剂得液体培养基培养植物材料得方法。由于液体中氧气含量较少,常需要通过搅动或振动培养液得方法以确保氧气得供给,采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养,其速度一般为50～100转／分,这种定期浸没得方法,既能使培养基均一,又能保证氧气得供给。
静止培养:滤纸桥培养