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铁皮石斛繁育种子袋生产技术规程
1范围
本标准规定了铁皮石斛真菌-种子袋生产前原料准备、铁皮石斛种子活力检验、真菌-种子袋生产关键技术、安全防护措施、质量要求、真菌-种子袋质量检验、标志、包装、运输和贮存等技术要求。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T3543.6农作物种子检验规程水分测定
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1真菌-种子袋Fungus-seedbags
一种专门为铁皮石斛种子在野外进行直播而设计的繁殖用品，由铁皮石斛种子、水苔等按照特定配比混合制成。
4真菌-种子袋原料准备
4.1准备茶包袋
采购透气、易降解的纸质茶包袋（长*宽：6.2*5.5cm），备用。
4.2菌粉制作
4.2.1菌株选择
选用石斛蜡壳菌（SerendipitaoficinaleX.J.Wang）专用菌株。
4.2.2菌株活化
该平板预先准备好马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA；马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L,琼脂20g/L，pH=5.8-6）；利用接种环，从试管斜面中取出一小块石斛蜡壳菌（SerendipitaoficinaleX.J.Wang）菌种，将菌块置于平板中心，用封口膜将平板密封，放置在25±2℃的培养室中进行暗培养，约10天，待真菌菌丝长满培养基表面，即可将其作为后续的接种物。
4.2.3配制培养基
a.配制马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB；配方：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L,pH=5.8-6）。
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b.分装300ml培养基至锥形瓶（500ml）中，用锡箔纸密封好瓶口，然后将装有培养基的锥形瓶放入高压灭菌锅中，设定条件为121℃下灭菌20分钟。灭菌完成后，将培养基转移到超净工作台上冷却至室温，以备后续使用。
4.2.4扩繁真菌
a.在超净工作台上，使用已灭菌的尖镊切取步骤4.2.2中获得的菌块，迅速将6-7块菌块（约1*1cm）转接到装有步骤4.2.3预备的液体培养基的锥形瓶中。
b.接菌操作完成后，立即用锡箔纸密封锥形瓶口，再用两层报纸再次包裹瓶口，用橡胶圈进行固定。
c.将含有培养基和菌块的锥形瓶放置于振荡培养箱中，启动仪器进行振荡培养（25℃±2℃,200转/分），以促进真菌的孵化扩繁。培养15天左右，菌丝就能长满；冬季，培养时间可能需要延长至20天左右，以确保菌丝生长充分。
4.2.5菌粉配制
a.利用尼龙网过滤步骤4.2.4中得到的含有培养基和菌丝的混合液，以分离出菌丝。移除溶液，仅保留菌丝，并使其自然沥干，得到纯净的菌丝。
b.将纯菌丝与琼脂以1∶2的重量比混合，放入多功能粉碎机中，进行4秒的快速粉碎，然后暂停机器，等待仪器完全停止，打开盖子，用干净玻璃棒进行搅拌，确保菌丝充分粉碎，再次启动粉碎机进行3秒的粉碎，以获得粒径均匀的菌粉。
c.将得到的菌粉倒入洁净的不锈钢托盘中，摊平，厚度不超过1cm。将托盘放入电热恒温鼓风干燥箱中，在28℃的温度下吹风烘干24-36小时（期间适当搅拌菌粉，确保菌粉充分干燥）。此过程完成后，使得菌粉的含水率降至大约10%，至此菌粉已准备好，可用于后续步骤。
5铁皮石斛种子活力检验
铁皮石斛种子使用前，先使用TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）染色法对种子活力进行测定，保证种子活力达到90%以上，备用。具体方法见附录A。
6真菌-种子袋生产技术
6.1配制菌粉+铁皮石斛种子混合粉末
称取200g步骤4.2.5获得的菌粉，再精确称取0.01g（约10000颗种子）活力达标的铁皮石斛种子，将菌粉和种子进行混合均匀，获得菌粉+种子混合粉末，使得每克菌粉+种子混合粉末中约含有50颗种子。
6.2分装水苔
取约0.03g干燥水苔，装入茶包袋中。
6.3分装菌粉+铁皮石斛种子混合粉末
使用不锈钢药勺取约0.2g菌粉+铁皮石斛种子混合粉末，装入含有0.08g水苔的茶包袋中，每袋茶包袋包含约10颗种子，折叠袋口，即可生产获得铁皮石斛真菌-种子袋。
6.4打包
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每50袋铁皮石斛真菌-种子袋，用橡皮筋捆成一捆；每100捆装入一个防水、防潮的自封袋中，抽真空，4℃条件贮存。
7安全防护措施
7.1应对生产操作人员进行安全防护知识培训，操作人员应了解所用试剂、仪器的使用说明以及注意事项。
7.2应对操作高压灭菌工作人员进行特种设备培训，且必须获得中华人民共和国特种设备安全管理