8大原代细胞纯化秘籍！实验成功率翻倍的底层逻辑都在这
原代细胞培养纯化是细胞生物学研究中的关键步骤，旨在从组织中分离并获得高纯度的特定细胞类型，为后续实验提供可靠的材料。原代细胞培养纯化的作用原理主要围绕抑制非目标细胞生长、促进目标细胞选择性增殖。原代细胞培养纯化需结合实验目的和细胞类型选择合适的方法。操作过程中需严格无菌、优化消化条件、检测细胞活性，并监控污染。通过综合运用多种方法，可获得高纯度、高活性的原代细胞，为后续实验提供可靠材料。
我们在介绍原代细胞纯化前需要了解原代培养的概念，因为很多小伙伴很容易分不清原代培养与原代细胞的概念：
原代培养（primaryculture），通俗地讲，就是第一次培养。它是指将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过程。原代培养的实质是初次培养，即培养物一经接种到培养皿中就不再分割，任其生长繁殖而不更换培养器皿；原代培养中的『代』并不是指细胞的『代』数；原代培养过程中不分割培养物不等于不更换培养基；植块培养不一定都是原代培养，植块培养有时候在培养物增长到一定程度后，也需要移植培养物到新的器皿再培养。原代细胞（primaryculturecell）是指从机体取出后立即培养的细胞。有人把培养的第1代细胞与传10代以内的细胞统称为原代细胞。
原代细胞培养纯化的主要方法：
1、机械分离法◆原理：利用物理方法（如切割、刮除）分离目标细胞。◆应用：适用于组织块较大、细胞分布不均的情况，如从器官中分离特定区域细胞；适用于多种类型细胞明显成片区生长，区域细胞纯度较高。◆操作：在显微镜下手动分离目标组织区域，避免混入其他细胞类型；在显微镜下观察，用记号笔在细胞培养瓶上勾画出杂细胞的分布区域，然后用细胞刮刀伸入瓶内，刮除杂细胞，保留目标细胞（常用于成纤维细胞和上皮细胞交错成块分布）。√优点：操作简单，成本低。×缺点：对细胞机械损伤较大，分离效果可能不如酶消化法。
2、酶消化法◆原理：使用胰蛋白酶、胶原酶等酶类消化组织，如胶原酶，特异性降解纤维化组织的胶原蛋白、消化肿瘤组织块，破坏来自间质的成纤维细胞，可获得较纯的癌细胞；中性蛋白酶，切割细胞外基质中的纤连蛋白和层粘连蛋白，释放单细胞。◆应用：广泛用于贴壁细胞（如成纤维细胞、上皮细胞），适用于纤维化组织（如胰腺、肝脏）、肿瘤组织、上皮细胞和内皮细胞的分离。◆操作：将组织剪碎后，加入适量酶液消化，通过控制消化时间和温度，使目标细胞脱离组织，同时避免消化过度。√优点：分离效率高，细胞活性好。×缺点：酶的成本较高，消化时间及效果难以控制，且可能对某些细胞类型有毒性。
3、差速贴壁分离法◆原理：利用不同种类细胞贴壁速度差异性及细胞敏感性不同，通过控制培养时间差或消化时间差，可选择性移除未贴壁或弱贴壁的细胞，从而分离目标细胞。◆应用：成纤维细胞对胰蛋白酶作用敏感，组织块或消化传代时，成纤维细胞常常先脱落；原代细胞悬液接种后，成纤维细胞贴壁速度比上皮细胞、心肌细胞快。◆操作：将刚从组织分散的细胞悬液接种于培养皿内，于37℃，5%CO2恒温培养箱中静置培养，0.5-2h后，吸取未贴壁细胞悬液，一般先贴壁细胞为成纤维类细胞，未贴壁悬液多为上皮类细胞。√优点：无需特殊试剂，操作简单。×缺点：分离周期长，纯度可能有限。
4、化学试剂抑制法◆原理：利用增殖期细胞的作用敏感性，通过抑制杂细胞增殖，从而避免少量杂细胞成为优势细胞，拉大目的细胞与杂细胞优劣势差而分离目标细胞。有些化学物质对成纤维细胞的生长有抑制作用，而对培养的目标细胞无明显影响。因此，在细胞贴壁生长或分裂后，利用这些化学物质抑制成纤维细胞生长，从而获得纯度较高的目标细胞。如阿糖胞苷通过抑制细胞DNA的合成，干扰细胞的增殖；嘌呤霉素作为蛋白合成抑制剂，能抑制细胞的生长。◆应用：阿糖胞苷在神经元、心肌等不增殖细胞；嘌呤霉素在微血管内皮细胞等贴壁增殖缓慢的细胞纯化作用。◆操作：将刚从组织分离出来的神经元细胞悬液接种于培养皿内，同时加入合适浓度的药物筛选，于37℃，5%CO2恒温培养箱中静置培养，药物作用2-5d后更换新鲜培养基。√优点：操作简便，成本较低，特定细胞类型效果明显，可与其他方法联合使用。×缺点：细胞损伤风险较高，纯化效果有限，过程不可控，批次差异大，结果不稳定，可能影响细胞功能。
5、密度梯度离心法◆原理：利用不同细胞类型的密度差异，通过离心分层。◆应用：适用于血液细胞等单细胞悬液（如淋巴细胞、单核细胞）的分离。◆操作：将细胞悬液叠加于密度梯度介质（如Ficoll）上，离心后不同细胞层分布在不同介质层中，收集目标细胞层。√优点：分离纯度高，适用范围广。×缺点：离心时间长，对操作技能要求较高。
6、免疫磁珠分选法◆原理：利用特异性抗体标记目标细胞，通过磁场分离。◆应用：高纯度分离特定细胞亚群