（三）目前常用的未知基因突变分析技术异源双链体形成分析（Heteroduplexanalysis,HA）单链构象多态性分析（Single-strandconformationanalysis,SSCP）变性梯度凝胶电泳（denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE）变性高效液相色谱分析（Denaturinghighperformanceliquidchromatography,DHPLC）第31页，共62页，星期日，2025年，2月5日体外蛋白截短实验（Proteintruncationtest,PTT）定量多重PCR技术（QuantitativemultiplexPCR,QM-PCR）多重探针连接依赖性扩增技术（MultiplexLigation-dependentProbeAmplifcation,MLPA)DNA序列分析（DNAsequencing)第32页，共62页，星期日，2025年，2月5日1.异源双链体形成分析（HA）由突变型和野生型DNA链形成的异源双链DNA在其错配处形成一个凸起，电泳时会产生与相应的同源双链DNA不同的迁移率，从而使两者得以分离。技术路线：PCR产物95?C变性5分钟，37?C复性?10分钟。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（0.2%硝酸银染色）第33页，共62页，星期日，2025年，2月5日2.变性梯度凝胶电泳（DGGE）利用不同DNA序列开始变性时对变性剂浓度的要求不同，在变性剂浓度梯度凝胶内电泳，野生型DNA和突变型DNA序列的差异所导致其变性点不同使两者的电泳迁移率出现差异第34页，共62页，星期日，2025年，2月5日3.单链构象多态性分析（SSCP）单链DNA在中性条件下会形成二级结构。这种二级结构依赖于其碱基的序列。即使只有一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构并可引起非变性条件下的电泳迁移率的差异。技术路线：PCR产物95?C变性5分钟，立即置冰上。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。条件：电泳缓冲液0.5?TBE，电压70v,4?C环境下电泳过夜（0.2%硝酸银染色）。第35页，共62页，星期日，2025年，2月5日4.体外蛋白截短试验（PTT）从蛋白质水平检测基因的突变。其原理是碱基缺失和插入导致的移码突变、碱基替换出现的无义突变均可使基因提前出现终止密码，从而截短mRNA翻译的蛋白质。技术路线：血细胞RNA?cDNA?RT-PCR?体外蛋白质合成?电泳分析截短了的蛋白质?相应基因片段的序列分析第36页，共62页，星期日，2025年，2月5日上游引物5’端均连接T7启动子序列GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCATGG[35S]甲硫氨酸，T7体外转录/翻译体系（兔网织红细胞提取物），30℃孵育90min，完成体外蛋白质合成。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳第37页，共62页，星期日，2025年，2月5日5.变性高效液相色谱分析（DHPLC）1995年OefnerandUnderhill首次报道DHPLC技术。其原理是在接近DNA融解温度条件下进行离子对反相高效液相色谱分析。DHPLC分析突变的原理：在DNA部分变性的条件下，变异型和野生型DNA可形成同源双链和异源双链．根据其在层析柱上保留的时间可以分辨出变异性型DNA.第38页，共62页，星期日，2025年，2月5日用离子对反相高效液相色谱检测DNA变异是基于同时存在同源双链和异源双链。异源双链的检出取决于高效液相色谱的温度。而色谱温度的选定与野生型DNA融解温度（Tm）有关。DHPLC与其它突变分析技术的比较:对单个核苷酸变异的检出率:SSCP技术,约75%；DHPLC,90%.第39页，共62页，星期日，2025年，2月5日DHPLC的优点：灵敏，准确；分析速度快，单个样本的分析时间仅需几分钟；容易实现自动化操作；适用于较大样本中基因突变的筛选。第40页，共62页，星期日，2025年，2月5日DHPLC分析：（野生型）第41页，共62页，星期日，2025年，2月5日DHPLC分析:突变型（单个碱基改变）第42页，共62页，星期日，2025年，2月5日DHPLC分析:突变型（单个碱基改变）第43页，共62页，星期日，2025年，2月5日6.定量多重PCR技术（QuantitativemultiplexPCR，Q-M-PCR）目前各实验室普遍采用的突变基因分析技术对基因微小突变的检测具有较高的敏感性，如对单个碱基改