1974年，提出了DNA重组实验具有潜在生物危险性的问题。后来，制定了有关DNA重组实验的准则，其目的是保证实验的安全和推动重组DNA的研究。这些准则参照了防止病原微生物污染的措施，以及根据对实验安全度的评定，采用物理密封(P1~P4)和生物学密封(B1和B2)两种方法。第31页，共49页，星期日，2025年，2月5日物理密封是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界扩散。实验规模在20L以下时，物理密封由密封设施、实验室设计和实验注意事项组成。密封程度分为P1、P2、P3和P4级，数字越大，密封水平越高。生物学密封要求用只有在特殊培养条件下才能生存的宿主，同时用不能转移至其它活细胞的载体，通过这样组合的宿主载体系统，可以防止重组菌向外扩散。按密封程度分B1和B2级，B2级的密封要求最严格。第32页，共49页，星期日，2025年，2月5日第二节动、植物细胞大规模培养动植物细胞培养是指动植物细胞在体外条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织。第33页，共49页，星期日，2025年，2月5日一、细胞融合技术细胞融合技术（cellfusiontechnology)，是指两个或更多个亲本细胞经酶法出去细胞壁得到两个球状原生质球，通过生物法、化学法或物理法等诱导融合形成单个细胞，获得新的重组子的过程。第34页，共49页，星期日，2025年，2月5日理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。第35页，共49页，星期日，2025年，2月5日关于发酵工程在现代生物技术中的应用第1页，共49页，星期日，2025年，2月5日第一节基因工程菌的发酵就生产流程而言，从发酵到分离、纯化目标产物，工程菌和常规微生物并无太多的差异。但工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，以及安全性等问题，使得工程菌的培养有着自身所特有的特点。第2页，共49页，星期日，2025年，2月5日（一）工程菌的稳定性1、基因工程菌不稳定的表现生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但是大量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生长得快得多，从而能替代有生产能力的菌株，这就导致基因的不稳定性。基因的不稳定性原因：质粒分离丢失、结构不稳定性表达产物的不稳定性（宿主细胞调节突变）第3页，共49页，星期日，2025年，2月5日质粒丢失当细胞分裂时一个子细胞没有接受质粒就出现分离丢失。质粒可分为高拷贝质粒（20拷贝/细胞）和低拷贝质粒（有时低到每个细胞一至二个拷贝）。低拷贝质粒有专门的机制保证在子代细胞中有相等的分配，高拷贝质粒通常很少遵循二分法分配到子代细胞。对于高拷贝质粒，几乎所有子细胞接受一些质粒，也有可能有的细胞没有接受质粒，当然形成无质粒细胞的可能性是低的（每百万细胞分裂中一个）。第4页，共49页，星期日，2025年，2月5日但在大的反应器中含有非常多的细胞，总会存在无质粒细胞，例如1000L发酵液，每毫升有109个细胞，总共就有1015个细胞，那么在这个反应器中就含有109个无质粒细胞。质粒的分离丢失可能受许多环境因素影响，如溶氧、温度、培养基组成和恒化器中的稀释速率。许多质粒也会形成多聚体，它是相同质粒附着在一起形成一个单位。第5页，共49页，星期日，2025年，2月5日第6页，共49页，星期日，2025年，2月5日质粒结构不稳定性除了分离不稳定性问题外，某些细胞保留质粒，但质粒结构发生改变，而不产生外源蛋白，减少对细胞的有害影响，这就是结构不稳定性。如果质粒发生突变，仍保留了抗生素抗性基因，但不合成外源蛋白，那么这些突变株仍能在含有抗生素的培养基中生长。而且由于不合成外源蛋白，生长得比原来的工程菌更快，使得在这种培养物中带有改变了的质粒占统治地位的菌，这种培养情况就是结构不稳定性。第7页，共49页，星期日，2025年，2月5日表达产物的不稳定性宿主细胞的突变也会造成生产能力的减少。这些突变通常改变细胞调节，结果减少目标蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表达的启动子，利用宿主细胞的启动子，如果宿主细胞启动子的改变，将大大改变质粒编码蛋白的生产水平。乳糖操纵子是常用是操纵子，通过加入乳糖或它的结构类似物（如IPTG）来启动表达，如果乳糖操纵子编码半乳糖苷透酶