关于原生质体的分离与融合第1页，共37页，星期日，2025年，2月5日什么是原生质体原生质体，是指出去细胞壁的植物细胞的部分。由Hanstein1980年提出在适当条件下，原生质体可以成功培养长出细胞壁，并通过细胞分裂。原生质体不仅对细胞融合研究有价值，且能通过裸露的质膜获得外源DNA、细胞器、细菌和病毒颗粒等。第2页，共37页，星期日，2025年，2月5日一、原生质体分离原生质体分离的基本原则是保证原生质体不受伤害并不损害其再生能力。1.机械法只有储藏组织中较大的、高度液泡化的细胞才能用于分离原生质体，如洋葱球茎鳞片、萝卜根、甜菜根等；缺点：产量低；方法枯燥无力；因破碎细胞释放物的存在，原生质体活力低。2.酶法Cocking在1960年证实了可用酶分离原生质体。Takabe等1968年首次用商业酶试剂分离原生质体，并在1971年获得再生植株。缺点是：不纯酶制剂所含的杂质可能会对原生质体产生不同程度的毒害作用。第3页，共37页，星期日，2025年，2月5日原生质体的分离第4页，共37页，星期日，2025年，2月5日二、影响原生质体分离的因素原生质体分离时主要考虑取材、酶的种类、纯度、酶液的渗透压、酶解时间、温度等。1组织和细胞材料的生理状态植物幼苗或新生枝的完全伸展叶片的叶肉组织是分离原生质体的最方便、最合适的植物材料。叶肉细胞排列松散，酶试剂很容易达到细胞壁。用于分离原生质体的愈伤组织或悬浮细胞应当处于生长早期或指数生长期。采用愈伤组织或悬浮细胞，采用其材料可以避免植株生长环境的不良影响，可以常年供应，易于控制新生细胞的年龄，处理时操作方便，无需消毒。第5页，共37页，星期日，2025年，2月5日二、影响原生质体分离的因素2酶纤维素和半纤维素是细胞壁的初生结构和次生结构的成分，果胶类物质是连接细胞胞间层的成分。纤维素酶（降解构成细胞壁的纤维素）、半纤维素酶、果胶酶（使细胞从组织中分开，以及细胞与细胞分开）酶活性与pH有关，4.7~6.0，温度一般在25~30℃第6页，共37页，星期日，2025年，2月5日二、影响原生质体分离的因素3渗透剂原生质体直接释放到培养基中会破裂，因此，在分离原生质体期间，须对原来细胞壁机械维持压力用原生质体分离混合液以及后来培养基的适当渗透压代替。在合适的渗透压溶液中，刚分离的原生质体看起来是球状的。第7页，共37页，星期日，2025年，2月5日二、影响原生质体分离的因素4原生质体的纯化酶消化后得到的混合物含有亚细胞碎片、未消化的细胞、破碎的和完整的原生质体。可通过对此混合物通过过滤、离心、漂洗联合的方法进行纯化。1）收集：原生质体混合液用滤网（40~100μm）去掉没有降解的细胞及组织，收集滤液。2）洗涤：将网下物低速离心，去掉上清液，再加无酶液的CPW液悬起起原生质体，再离心，弃上清，重复几次即可。第8页，共37页，星期日，2025年，2月5日3）纯化（上浮法和下沉法）上浮法是将酶解的原生质体与蔗糖溶液（23%左右）混合。下沉法是讲原生质体与13%的甘露醇混合，然后加到23%的蔗糖溶液顶部，形成一个界面。两种方法中，均在离心5~10分钟后，在蔗糖溶液顶部形成一条原生质体带。用吸管将带轻轻吸出来，悬浮离心，稀释后用于培养。第9页，共37页，星期日，2025年，2月5日二、影响原生质体分离的因素5原生质体的活力测定和密度原生质体的真正活力使原生质体有能力通过持续有丝分裂，再生成愈伤组织，并最终再生成植株。测定原生质体活力的方法主要有：FDA（荧光素二乙酸）染色法；酚藏红花（CFW）染色法；测定呼吸强度法等。第10页，共37页，星期日，2025年，2月5日第11页，共37页，星期日，2025年，2月5日第12页，共37页，星期日，2025年，2月5日影响原生质体分离的因素6培养基成分培养基中应当去除铵，因为它对原生质体的生存是有害的，而铁、锌的含量也应当减少。另外，钙的浓度应当比通常培养细胞所需的浓度增加2~4倍，提高钙的浓度能改善膜的稳定性。葡萄糖是最好最可靠的碳源，其次为蔗糖。7环境因子一般来说，刚开始培养时高光强会抑制原生质体的生长，因此应先在黑暗或弱光下培养几天，再将其转移到一般光强下培养。温度范围20~28度适宜，pH范围5.5~5.9适宜。第13页，共37页，星期日，2025年，2月5日三、原生质体培养原生质体培养1.液体浅层培养（Liquid