第1页，共21页，星期日，2025年，2月5日实验目的学习将重组质粒DNA导入大肠杆菌的方法学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法为下一步重组体筛选做准备第2页，共21页，星期日，2025年，2月5日实验原理遗传学中转化的基本含义是使细胞获得一新的可遗传的表型性状。分子克隆中用人工的方法将重组质粒DNA导入大肠杆菌细胞，使携带有重组质粒的大肠杆菌获得在抗生素平板上生长的能力，从而与不携带重组质粒的的细菌区分开来，这个过程就是转化。将重组质粒转化进受体细菌时，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。大肠杆菌细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞即感受态细胞(Competentcells)。第3页，共21页，星期日，2025年，2月5日转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。0.1mol/LCaCl2是一种低渗溶液，在0℃低温处理大肠杆菌细胞时，细胞膨胀成球形，DNA可吸附在其表面。在短暂的热冲击（如42℃）下，细胞可吸收外源DNA。为了鉴定这些转化子，须利用质粒编码的筛选标记，这些标记赋予细菌新的表型，是成功转化的细菌很容易被筛选出来。pET32a质粒带有氨苄西林抗性基因（Ampr），其重组体转化的大肠杆菌能够在含氨苄西林的培养基上生长，而未转化的受体菌则不能再这种培养基上生长。
第4页，共21页，星期日，2025年，2月5日Ampr：氨苄西林抗性基因–β内酰胺酶多克隆位点（MCS）：外源DNA片段的插入位点Amps菌株Ampr涂布于含Amp的培养基上，可以生长。次日可见白色菌落--转化子。培养基上含有X-Gal和IPTG时，可使用蓝白斑筛选方法鉴别真正的重组的转化子。pET32apET32a第5页，共21页，星期日，2025年，2月5日结构的三大要素：多克隆位点选择标记（耐药性，LacZ）复制起始位点种类：质粒噬菌体酵母人工染色体（YAC）反转录病毒载体表达载体等第6页，共21页，星期日，2025年，2月5日第7页，共21页，星期日，2025年，2月5日pET-32aVectorThepETSystemisthemostpowerfulsystemyetdevelopedforthecloningandexpressionofrecombinantproteinsinE.coli.第8页，共21页，星期日，2025年，2月5日pET-32cloning/expressionregion第9页，共21页，星期日，2025年，2月5日Vector(pET-32a)Genefragment(SmPR10)pET32a-SmPR10第10页，共21页，星期日，2025年，2月5日材料、设备及试剂材料E.coliDH5α菌株:R-、M-、Amp-(转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。）pET32a-SmPR10质粒DNA（浓度：2ng/μl):实验室自制设备恒温摇床；电热恒温培养箱；台式高速离心机；超净工作台；低温冰箱；恒温水浴锅；分光光度计；微量移液枪。第11页，共21页，星期日，2025年，2月5日试剂
1、LB固体和液体培养基LB培养基配方：（单位g/L）胰蛋白胨 10酵母提取物 5NaCl 10琼脂粉（1.5%）15g（注：LB液体培养基不加琼脂粉）按配方称量药品,加入一定量的ddH2O后置电炉上加热熔解琼脂，待琼脂完全熔解后加入ddH2O定容至1000ml,用NaOH调节pH至7.0。121℃湿热高压灭菌20分钟，待冷却至60℃左右,在超净工作台中加入一定量的Amp储存液,使终浓度为100μg/ml,摇匀后用培养皿铺板。第1