第三节核酸酶第23页，共74页，星期日，2025年，2月5日ds-DNA结构:切口,缺口,断口缺口(gap)切口(nick)断口(cut)3HOP53HOP5第24页，共74页，星期日，2025年，2月5日一.外切酶III（ExoIII）1.一般特点：来自于E.coli，分子量28,000kD2.催化反应类型1)外切酶活性：3’5’，产生5’-单磷酸核苷酸和具各种结构的ds-DNA，pH7.6-8.52)核酸酶H活性：除去DNA-RNA杂交分子中的RNA分子，pH7.6-8.53)3’-磷酸酶活性：除去3’-磷酸基后形成3’-OH端，有利于DNA聚合酶反应，pH6.8-7.44)内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将DNA键切开，pH7.6-8.5第25页，共74页，星期日，2025年，2月5日3.??外切酶活性特点1)反应底物：互补ds-DNA2)碱基释放速度：CA-TG3)反应产物：5’-单磷酸核苷和具缺口或5’-端突起的ds-DNA，过度反应将导致DNA降解4.??用途1)???核酸（DNA）标记2)???基因突变----缺失3)???DNA序列测定时作顺序缺失5.??使用注意事项1)???正式使用前，测定在一定条件下酶的反应速度2)???在一定条件下，ExoIII不能作用GC富集区(来自于cDNA加尾)第26页，共74页，星期日，2025年，2月5日5P5P5P5P5P3HO3HO3HO3HO3HO3HO3HO3HOOH3OH3OH3OH3P5P5P5P5P5P5P53HOP5OH3P5RNaseHExoIII的外切酶和RNaseH的作用第27页，共74页，星期日，2025年，2月5日1234abc1234abc1234abc1234abc1234abc234abc34abc4abcabcExoIII用于顺序缺失ExoIIIExoIII[α-32P][α-32P]dCTPdCTP5PP55PP53HOOH33HOOH3ExoIII用于DNA标记第28页，共74页，星期日，2025年，2月5日二.λ外切酶1.反应特点1)作用底物:要求5’-PO4基;不作用含切口的DNA分子2)作用方向与产物：5’3’;产生5’-P核苷和3’-突起的ds-DNA2.用途：DNA定序测定;除去5’-端突起，产生3’-端突起，便于加尾3’HO3’HO3’HOOH3’OH3’OH3’5’P5’P5’PP5’P5’P5’AAAAAAAAAAAATdT+dATP第29页，共74页，星期日，2025年，2月5日三.核酸酶Bal311.?一般特点：胞外酶；具DNase和RNase活性；由“快”和“慢”两种成分构成2.?催化反应特点1)底物：ss-DNA，ds-DNA，RNA(外切与内切活性)2)作用方向与产物：5’3’和3’5’同时进行，但反应速度不同；产生5’-单磷酸核苷和缩短的ds-DNA3.??用途：基因突变--缺失;绘制限制酶谱;DNA定序(与ExoIII相同)，其优点是Bal31酶活依赖于Ca++和Mg++，Ca++在反应完毕后可用EGTA（乙二醇四乙酸）灭活而不影响Mg++浓度，后者是限制酶活性必需的4.?使用注意事项：1)应作预备实验，因每批酶制品的“快”“慢”酶含量不同2)DNA两条链碱基组成不同，终止反应时存在单链突起，需要补平第30页，共74页，星期日，2025年，2月5日5PP53