RNA的琼脂糖电泳检测变性条件下，甲醛是最常用的变性剂，也可用加热或尿素等变性剂。28S和18S亮度2:1rRNA分子具有确定的大小和核苷酸序列，特别是28S和18S特征性条带是电泳鉴定总RNA纯度和完整性的重要参数。*第93页，共114页，星期日，2025年，2月5日2mRNA的纯化5’端帽子结构和3’端的polyA尾巴寡聚(dT)-纤维素柱色谱法*第94页，共114页，星期日，2025年，2月5日PolyATTractmRNA的分离纯化过程简图。*第95页，共114页，星期日，2025年，2月5日3cDNA的合成*第96页，共114页，星期日，2025年，2月5日cDNA合成过程示意图反转录酶DNA聚合酶*第97页，共114页，星期日，2025年，2月5日定向cDNA合成及分子修饰*第98页，共114页，星期日，2025年，2月5日cDNA：0.5-8kb常用Uni-zapXR（一种λ噬菌粒载体）做载体，它具备噬菌体的高效性和质粒载体系统利用蓝白斑筛选的便利，可容纳0-10kbDNA插入片段，含有pBluescript载体的全部序列。重组后可通过体内剪切反应（InVivoExcision）将cDNA插入片段转移到质粒系统中进行筛选、克隆和序列分析。4cDNA文库的构建*第99页，共114页，星期日，2025年，2月5日1967年，世界上有五个实验室几乎同时发现DNA连接酶，特别是1970年H.G.Khorana等发现的T4DNA连接酶具有更高的连接活性。2）DNA连接酶的发现和应用*第61页，共114页，星期日，2025年，2月5日DNA连接酶
（DNAligase）一种封闭DNA链上缺口的酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5’-PO4与另一DNA链的3’-OH生成磷酸二酯键。E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶*第62页，共114页，星期日，2025年，2月5日连接反应体系三蒸水0.5μL目的基因6μL载体2μL缓冲液1μL连接酶0.5μL温度4℃,16℃*第63页，共114页，星期日，2025年，2月5日DNA连接酶只能作用于双链DNA分子而不能将二个单链DNA分子连接。T4噬菌体DNA连接酶可连接DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。大肠杆菌DNA连接酶不能连接平末端DNA分子。DNA重组技术常用T4噬菌体DNA连接酶。注意：*第64页，共114页，星期日，2025年，2月5日5.4细菌转化与目标DNA分子的增殖细菌转化（transformation），是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株。接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。*第65页，共114页，星期日，2025年，2月5日为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取DNA的能力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞（competentcells）。感受态细胞（competentcells）*第66页，共114页，星期日，2025年，2月5日CaCl2法大肠杆菌培养至OD=0.2-0.80℃预处理的低渗CaCl2-甘油溶液42℃90s或37℃5min转化效率：5×106~2×107个/μgDNA。*第67页，共114页，星期日，2025年，2月5日电击法电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，介质中的DNA进入细胞质。将生长至对数中期的E.coli菌液冷却至4℃后离心，洗菌后用10%的甘油悬浮，将高密度菌液（~2×1010/ml）置于特制的电击杯中进行电击。*第68页，共114页，星期日，2025年，2月5日电穿孔仪电击杯*第69页，共114页，星期日，2025年，2月5日细菌转化及蓝白斑筛选（Blue-whitescreening）*第70页，共114页，星期日，2025年，2月5日5.5核酸凝胶电泳技术一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。*第71页，共114页，星期日，2025年，2月5日核酸电泳的用途确定DNA或RNA的大小纯化DNA或RNA片段分离DNA或RNA片段*第7