MTT染色计数法MTT:3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。原理：活细胞内的线粒体脱氢酶能将MTT转变为不可溶性的紫色的甲臜结晶，可溶于二甲亚砜（DMSO）。MTT结晶形成的量与细胞数成正比。用酶标仪在490nm处测定其吸光值，可间接反映活细胞数量。灵敏度高；MTT有致癌性，DMSO极易渗透皮肤第62页，共113页，星期日，2025年，2月5日三、细胞传代悬浮细胞的传代：加入一倍或几倍的生长液，然后分种两只或多只培养瓶贴壁细胞的传代：先消化再分种第63页，共113页，星期日，2025年，2月5日贴壁细胞传代的注意事项消化前确定细胞有无污染加入消化液量要适当，摇动时能盖满单层细胞即可消化时间不宜过长，室温静置2-5min终止消化要先去掉消化液，然后加入有血清的培养基分种数量取决于细胞数和细胞特性，多数以20-30万个/ml，每次1传2或1传3为宜；已培养过的瓶子可再次使用，但不要超过2-3次二倍体细胞每次传代时应写上传代次数传代后每天或隔一天换液，3-5d传代一次第64页，共113页，星期日，2025年，2月5日四、细胞的冻存和复苏1.细胞的冻存采用液氮低温（-196℃）冻存：加保护剂如甘油和二甲亚砜；冷冻速度以1℃/min的速度下降为宜注意事项：冻存前一天换液培养；细胞密度以1-2×106个/ml为宜；冻存用培养基应与实际使用的一致，DMSO过滤除菌；检查安踣的密封性；标签要写上细胞名称，编号和冻存日期。第65页，共113页，星期日，2025年，2月5日2.细胞的复苏（总的要求是快融）注意事项：操作中注意防护，戴面罩和手套；从液氮中取出后，立即丢入37-40℃温水的搪瓷杯中，并搅动加速融化；用乙醇消毒安踣外表；尽早除去二甲亚砜，离心，换新鲜培养液；隔天观察细胞生长情况，再换液一次。第66页，共113页，星期日，2025年，2月5日一、动物细胞大规模培养的方法二、动物细胞培养的操作方式第六节动物细胞大量培养的方法和操作方式第67页，共113页，星期日，2025年，2月5日一、动物细胞大规模培养的方法依细胞种类：原代培养传代培养依培养基：液体培养固体培养第68页，共113页，星期日，2025年，2月5日依培养容器和方式：静止培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养中空纤维培养、固定床或流化床培养第69页，共113页，星期日，2025年，2月5日从生产实际分为：悬浮培养贴壁培养贴壁-悬浮培养第70页，共113页，星期日，2025年，2月5日1.悬浮培养悬浮培养：即让细胞自由地悬浮于培养基内生长繁殖。适用于一切种类的非贴壁依赖性细胞（悬浮细胞），也适用于兼性贴壁细胞。优点：操作简便，培养条件比较单一，传质和传氧较好，容易扩大培养规模，在培养设备的设计和实际操作中可借鉴细菌发酵的经验；可连续收集部分细胞进行移植继代培养，传代时无需消化分散，免遭酶类、EDTA及机械损害；细胞收率高，并可连续测定细胞浓度，还有可能实现大规模直接克隆培养。缺点：细胞体积较小，较难采用灌流培养，细胞密度较低第71页，共113页，星期日，2025年，2月5日培养过程中，为确保细胞呈单颗粒均匀悬浮状态，需采用搅拌或气升式反应器，以较低搅拌速度及一定速度通入含5%CO2的无菌空气，保持细胞悬浮状态并维持培养液溶解氧和pH。不同细胞悬浮条件不同。为使细胞不致凝集、成团或沉淀，在配制培养基的基础盐溶液中不加钙和镁离子。间歇或连续更换部分培养液，可维持pH值，若使用HEPES缓冲盐溶液可不必连续通入含5%CO2的空气。第72页，共113页，星期日，2025年，2月5日2.贴壁培养贴壁培养：是必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。适用于一切贴壁依赖性细胞，也适用于兼性贴壁细胞。优点：适用的细胞种类广，较容易采用灌流培养缺点：操作麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积，传代或扩大培养时需先消化，培养条件不易均一，传质和传氧较差。第73页，共113页，星期日，2025年，2月5日3.贴壁-悬浮培养（假悬浮培养）微载体培养包埋和微囊培养结团培养第74页，共113页，星期日，2025年，2月5日（1）微载体培养微载体培养法：将动物细胞吸附于微载体表面，在培养液中进行悬浮培