核酸的理化性质研究方法
核酸得化学结构和作为高聚物决定其理化性质:核酸得糖苷键和磷酸二酯键:可被水解;磷酸基和碱基:酸碱性质;碱基:紫外吸收特性;双螺旋结构:变性和复性。
一、核酸得水解(一)酸水解糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解,产生嘌呤和嘧啶碱(二)碱水解RNA得磷酸酯键更易被碱水解(RNA得核糖上有2’-OH,在碱作用下形成磷酸三酯,极不稳定易水解,产生核苷2’,3’-环磷酸酯,继续水解产生2’-核苷酸和3’-核苷酸)
(三)酶水解专一水解核酸得磷酸二酯键得酶称为核酸酶(nuclease)。能识别特定得核苷酸顺序,并从特定位点水解核酸得内切酶称为限制性核酸内切酶(限制酶)。
1、核酸酶得分类(1)按底物专一性分类:核糖核酸酶(ribonuclease,RNase):作用于核糖核酸;脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease,DNase):作用于脱氧核糖核酸;(2)按底物作用得方式分类:核酸外切酶(endonuclease):从多核苷酸链得末端开始,逐个将核苷酸切下得酶;核酸内切酶(exonuclease):从多核苷酸链得内部开始水解核酸得酶。
(3)按磷酸二酯键断裂得方式分类:一种就是在3’-OH与磷酸基之间断裂,其产物就是5’-磷酸核苷酸或寡核苷酸,如(1);另一种就是在5’-OH与磷酸基之间断裂,其产物就是3’-磷酸核苷酸或寡核苷酸,如(2)。PPPNNN(1)(2)(1)(2)5’3’
2、核糖核酸酶类牛胰核糖核酸酶、核糖核酸酶T1、核糖核酸酶T2等;3、脱氧核糖核酸酶类牛胰脱氧核糖核酸酶、牛脾脱氧核糖核酸酶、限制性内切酶等。4、N－糖苷酶
核酸酶底物切点产物胰核糖核酸酶RNA内切核酸酶嘧啶3’端,留下3’－P3’嘧啶单核苷酸或3’-嘧啶核苷酸结尾得寡聚核苷酸蛇毒磷酸二酯酶RNA,DNA外切核酸酶3’端,留下3’－OH5’－单核苷酸牛脾磷酸二酯酶RNA,DNA外切核酸酶5’端,留下5’－OH3’－单核苷酸大肠杆菌核酸外切酶Ⅰ单链DNA外切核酸酶5’端,留下5’－OH3’－单核苷酸及一个末尾二核苷酸大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ双链DNA外切核酸酶3’端,留下3’－OH5’－单核苷酸
二、核酸得酸碱性质1、碱基得解离C得N3有一对未共用电子,可与质子结合;C得烯醇式羟基具有释放质子得能力;U得N3酸性解离得pK1’=9、5;T得N3酸性解离得pK1’=9、9;A得N1pK1’=4、15G得N7pK1’=3、2N1pK2’=9、6;N9pK3’=12、4
2、核苷得解离戊糖得存在增强了碱基得酸性解离:A得N1pK1’由4、15降为3、63;C得pK1’由4、6降为4、15;
大家学习辛苦了，还是要坚持继续保持安静
3、核苷酸得解离HpK1’＝1.5
核苷酸有磷酸与碱基,为两性电介质;U得碱基碱性极弱,不能形成兼性离子;A,G,C中,pK1’:第一磷酸基-PO3H2得解离;pK2’:含氮环＝N+H-得解离;pK3’:第二磷酸基-PO3H-得解离;故其pI＝(pK1’+pK2’)／2DNA变性双链打开后,碱基即参与酸碱滴定。
三、核酸得紫外吸收Py和Pu有共轭双键,使碱基、核苷、核苷酸和核酸能吸收紫外光,最大吸收峰为260nm。不同核苷酸
A260＝εCL公式中,A260为光密度ε,为260nm处得碱苦摩尔消光系数C,为每升溶液中碱基得摩尔数L,为比色杯内径得厚度如:已知鸟嘌呤溶液得A260＝0、325,ε＝7、2X103,L＝1cm,则:C＝0、325/(7、2X103X1)＝4、5X10-5(mol/l)紫外光区最大吸收:260nm,定性定量分析
第五节DNA得理化性质及其应用一、核酸得一般理化性质核酸具有酸性;粘度大;
二、DNA得变性在理化因素作用下,DNA双螺旋得两条互补链松散而分开成为单链,从而导致DNA得理化性质及生物学性质发生改变,这种现象称为DNA得变性(denaturation)。变性时维持双螺旋稳定性得氢键断裂,碱基间得堆积力遭到破坏,但不涉及到其一级结构得改变。
①增色效应:指DNA变性后对260nm紫外光得光吸收度增加得现象;②旋光性下降;③粘度降低;④生物学功能丧失或改变。引起DNA变性得因素主要有:①高温,②强酸、强碱,③有机溶剂等。DNA变性后得性质改变:
DNA得变性温度:加热DNA溶液,使其对260nm紫外光得吸收度突然增加,达到其最大值一半时得温度,就就是DNA得变性温度(融解温度,Tm)。
Tm得高低与DNA分子中G+C得含量有关,G+C得含量越高,则Tm越高。Tm＝69、3+0、41(％G＋C)