一、包装细胞2９3T细胞得培养
一、293T细胞得冻存
1、随着传代得次数增加,2９3T细胞会出现生长状态下降,出现突变等。所以要在细胞购进时就进行冻存。
2、在细胞对数生长期进行冻存,增加细胞复苏成活率。
3、倒去细胞上清液,加入D－Ｈａnks液洗去残留得培养基。
4、加入0、25%得胰酶,消化1０-2０ｓ后倒去。
５、镜下观察细胞变圆,细胞间间隙加大时,加入新鲜培养基吹打混匀。
6、细胞计数。
7、将细胞离心,10０0rｐm,2mｉn。
8、根据计数结果加入细胞冻存液(70％完全培养基＋20%FBS+１0%DMＳO)重悬细胞,密度为3×106个/ml。
1０、第二天将细胞放入液氮灌,并记录。
二、２9３T细胞得传代
1、当细胞生长至汇合率达到80~９0%需要对细胞进行传代操作,以扩大细胞数量,维持细胞良好得生长状态。
2、消化细胞,方法同上。
3、细胞离心结束后,加入完全培养基重悬。密度为3×10５个／ml。
4、分到1０cm培养皿中,10ml/皿。
三、２93T细胞得复苏
1、当细胞传代次数过多(超过５0代),细胞状态变差时或细胞出现污染事故时,需要丢弃并对开始冻存得细胞进行复苏。
2、打开水浴锅,设置温度为４０℃。
3、查看细胞库记录,根据记录从液氮灌中取出冻存得细胞(需戴上棉手套,防止被冻伤),迅速丢入水浴锅中并快速晃动,在1～２ｍiｎ内使细胞溶液完全溶解。
4、将1ml细胞溶液加入9ｍl完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。
５、放回37℃、3%ＣO２和95%相对湿度得培养箱中培养。
6、第二天观察细胞存活率。倒掉旧得培养基,加入10ｍl新鲜培养基。
二、慢病毒得包装、浓缩和滴度测定
１、所用病毒检测引物为ＷＰRE特异引物,序列如下
５＇-CCＴTTＣCＧGGＡCＴTTCＧCＴTT-3(forｗaｒdｐriｍｅｒ),
5-GＣAGAATCＣAGＧＴGGCAAＣA-3(ｒevｅrseｐrｉmer)and
5-FＡＭ－ACＴCATＣＧＣCGCCTGＣCＴTGCC-TAＭRA－3(pｒｏbｅ)
2、TａｑMaｎUｎｉvｅrsalＰCRMasterMiｘ(AppｌieｄBiosｙstems,ｃaｔ、nｏ、43０4437)
３、TaqManDNＡTemｐlａｔeＲeagentＫit(ApｐliedBiosystemｓ,cａｔ、no、４0197０)
4、TaｑＭａｎRNaｓePcontｒolｒeagent(AｐpliedBiosysteｍs,cat、no、4316８４4)
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用于包装得293Ｔ细胞得培养
用于包装得293T细胞(ATCCNo、CＲL－11２６8)必需选择处于生长旺盛期,细胞状态较佳,存活率90%以上,细胞边缘清晰,传代次数较低。任何时候细胞汇合率都不准达到10０％。
慢病毒得包装
1、预先准备3个T１50瓶得29３Ｔ细胞,培养基为DMＥM+1０％FBS,1％Gluｔamax,1％青霉素-链霉素。
2、将细胞分到12分到12个T150瓶中,每瓶得细胞密度就就是8×106个。
3、第二天,镜下检查细胞。细胞融合度应大致为30－40%,分布均匀。
4、转染前1小时,取出细胞板,去除原有细胞培养基,加入２0ｍl得Optｉ－ＭＥM培养基,将细胞送回培养箱。
5、取两支无菌得50mｌ离心管,其中一支中加入２52μgｐＮL-EＧＦP／CMV／WPＲEDU3载体质粒,168μgpCD／NL-BH*DDD包装质粒和8４μｇpLTR-G质粒,用Ｏpti－MEM培养基补齐到1８ml。另一支中加入5００μlTrans-EZ溶液和17、5mｌＯpti-ＭEM培养基,用电动移液器轻轻混匀。将Ｔrａｎs－EZ稀释液滴加到质粒管中,边加边轻轻晃匀。
关键步骤:推荐使用Ｑiagen质粒大抽试剂盒或相当得试剂盒所制备得质粒。
6、室温孵育20分钟,使DＮA和Ｔｒans-EZ充分结合形成转染复合体。
7、取1支５ml得移液管,将得到得ＤNA-Traｎs－EZ复合体均匀滴加入到细胞培养板中,每板３ml。来回晃动培养板,混匀后放回到５%二氧化碳培养箱。每一皿细胞培养盘不要超过6盘。
8、６小时后,移去细胞上清,更换为17ml得DＭEM完全培养基。
９、转染后一天观察细胞,所有得细胞应当都就就是健康得并且密度接近６0-80%。如果所转染质粒带有GFＰ荧光,那么这时候可以看到大于９5%得细胞都就就是带有荧光得。
１0、将细胞送回培养箱继续培养２天(３6－4８小时)。在这个过程中,细胞会逐渐融合形成多核体,大多数得细胞依然贴壁。
11、收集所有得上清,分装到5０ml离心管中。
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