非融合蛋白特点：1、表达时要求高：SD序列与ATG的距离要合适。即使改变2-3个碱基，表达效率也会大受影响。2、优点：能够较好地保持原来蛋白的活性。3、缺点：在宿主细胞内容易被蛋白酶降解，蛋白产量低；分离纯化费时费力，成本较高。第30页，共57页，星期日，2025年，2月5日非融合蛋白抗宿主蛋白酶降解方法：1、选用Ion-（黄嘌呤核苷）营养缺陷型宿主菌2、利用细菌蛋白酶抑制剂第31页，共57页，星期日，2025年，2月5日融合蛋白：是指蛋白质的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列编码，C端由真核DNA的完整序列编码。这样的蛋白质有一段短的原核多肽或具有其他功能的多肽和真核蛋白质结合在一起，故称为融合蛋白。3.3.7融合蛋白的表达及纯化第32页，共57页，星期日，2025年，2月5日融合型蛋白表达PSDForeignDNA融合型表达载体融合基因第33页，共57页，星期日，2025年，2月5日融合蛋白的表达及纯化1、构建融合蛋白表达载体：在外源蛋白的N或C端加标记物（如谷胱甘肽S-转移酶标记物、6×组氨酸标记物、Flag或HA肽段标记物、CBP标记物等）；在标记物和外源蛋白之间插入一段可被蛋白酶识别的氨基酸序列。2、转化原核细胞并诱导表达3、裂解细胞，亲和柱层析分离融合蛋白4、切割融合蛋白获得目的蛋白主要步骤：第34页，共57页，星期日，2025年，2月5日例：谷胱甘肽S-转移酶标记物第35页，共57页，星期日，2025年，2月5日融合蛋白质的纯化的基本原理：利用与融合蛋白质配偶体相对应的配体作为吸附剂，制备亲和层析柱，通过配偶体与配体之间的相互作用，过柱的融合蛋白质被滞留下来，其它蛋白质则流出柱外，经洗脱处理，便可回收到纯化的融合蛋白质。第36页，共57页，星期日，2025年，2月5日融合蛋白质中目的蛋白的纯化1.溴化氰（CNBr）切割法：能特异性的从甲硫氨酸残基处切割多肽链。如胰岛素的制备。2.胰蛋白酶切割法：能从精氨酸或是赖氨酸残基羧基一侧进行特异性的切割。3.凝血因子Xa切割法：能唯一地从特异识别序列C－末端切割多肽第37页，共57页，星期日，2025年，2月5日3.3.9增强蛋白质的稳定性3.3.10DNA整合入宿主染色体中第38页，共57页，星期日，2025年，2月5日3.3.11加强分泌外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位:1.细胞质中表达2.周质中表达3.胞外表达第39页，共57页，星期日，2025年，2月5日1、细胞质中表达:外源基因在大肠杆菌寄主细胞质中高效表达时，常会发生一种特殊的生理现象，形成包含体。包含体：存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。影响其形成的关键因素：电荷的平均数、形成转角的氨基酸残基组分第40页，共57页，星期日，2025年，2月5日第1页，共57页，星期日，2025年，2月5日第2页，共57页，星期日，2025年，2月5日目的基因载体体外重组重组子（杂合DNA）转化受体细胞筛选阳性克隆大量扩增，获得子代DNA基因克隆的技术路线第3页，共57页，星期日，2025年，2月5日大肠杆菌表达体系第4页，共57页，星期日，2025年，2月5日大肠杆菌表达体系优越性：1.对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控的分子机理有深刻的了解；2.是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体；3.许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、高水平的表达；4.大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量生产。第5页，共57页，星期日，2025年，2月5日大肠杆菌中表达体系的不足：1.真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。2.真核基因的转录信号同原核的不同。细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。3.真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异，影响真核基因mRNA稳定性。第6页，共57页，星期日，2025年，2月5日4.许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰（正确折叠和