c.dNTP四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）是DNA合成的基本原料，PCR反应中dNTP含量太低，PCR扩增产量太少、易出现假阴性。过高的dNTP浓度会导致聚合将其错误掺入，因此应当避免。第62页，共90页，星期日，2025年，2月5日d.模板PCR可以以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增。不过RNA的扩增首先逆转录成cDNA后才能进行PCR循环。不同来源的核酸标本必须经处理后才能用于PCR的扩增，处理不当或处理过程中DNA掉失都会导致PCR扩增失败。采集标本方法不当，未能获得所要检测的靶DNA都会导致出现假阴性。但是如果待扩增标本中模板DNA浓度太高也会导致扩增失败。第63页，共90页，星期日，2025年，2月5日基本原理采用随机合成的寡核苷酸（通常10bp）作PCR反应的引物，对所研究生物基因组DNA进行PCR扩增，经过30－40个循环，即可得到大量的DNA片段，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、EB染色、紫外下显示RAPD带纹。第30页，共90页，星期日，2025年，2月5日由于整个基因组存在众多反向重复序列，因此须对每一随机引物单独进行PCR。单一引物与反向重复序列结合。使重复序列之间的区域得以扩增。引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，导致PCR产物增加、缺少或发生分子量变化。若PCR产物增加或缺少，则产生RAPD标记。第31页，共90页，星期日，2025年，2月5日技术路线DNA的提取PCR反应凝胶电泳选择随机引物图谱分析第32页，共90页，星期日，2025年，2月5日与RFLP的比较相同之处：都从琼脂糖凝胶上DAN条带的多态性来反映基因结构上的多态性；不同之处：RFLP用限制性内切酶消化DNA，通过分析限制性酶切片端的多态性，来显示DNA的结构的多态性；而RAPD是利用PCR技术从扩增的DNA片段上分析多态性。由于片段被引物选择地扩增，并不是所有序列都扩增，扩增了的片断能在凝胶上清晰地显现出来，这样就可以通过同种引物扩增条带的多态性，反映出模板的多态性。第33页，共90页，星期日，2025年，2月5日与常规PCR的比较常规PCR需要两个引物，每个引物分子15－30个核苷酸，引物顺序根据扩增的基因两端的顺序设计，因而要进行PCR时，必需知道待扩增基因的顺序；RAPD分析时，只需一个引物，长度10个核苷酸左右，引物顺序是随机的，因而可在对被检对象无任何分子生物学资料的情况下对其基因组进行分析。第34页，共90页，星期日，2025年，2月5日（1）不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息；（2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子；（3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；（4）DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；（5）实验重复性较差，结果可靠性较低。RAPD标记的主要特点第35页，共90页，星期日，2025年，2月5日RAPD的缺点RAPD图谱中某些弱带重复性较差，而且目前该法在引物长度和序列及应用的引物数目、扩增反应条件等实验技术方面未标准化，影响了不同条件下结果的可比性；每个标记含有的信息量小；有假阳性或假阴性结果；显性标记，无法区分从一个位点扩增的DNA片段是纯合的还是杂合的，无法进行等位基因分析。用在种以上类群间的比较时无法得到可靠的遗传距离。第36页，共90页，星期日，2025年，2月5日二）扩增片段长度多态性（Amplifiedrestrictionfragmentpolymorphism,AFLP）AFLP是1993年由荷兰科学家Zabeau等人将PCR与RFLP结合起来，创造了AFLP分析技术。AFLP标记是选择性扩增基因组DNA酶切片段所产生的扩增产物的多态性，其实质也是显示限制性内切酶酶切片段的长度多态性，只不过这种多态性是以扩增片段的长度不同被检测出来。第37页，共90页，星期日，2025年，2月5日基本原理首先用限制性内切酶酶解基因组DNA，形成许多大小不等的随机限制性片段；接着在这些片段的两端连接上特定的寡聚核苷酸接头（Oligonuleotideadapter）；然后根据接头序列设计引物，由于限制性片段太多，全部扩增则产物难以在胶上分开，为此在引物的3’端加入1-3个选择性碱基，这样只有那些能与选择性碱基配对的片段才能与引物结合，成为模板被扩增，从而达到对限制性片段进行选择扩增的目的；最后通过聚丙烯酰胺