微专题——PCR技术
;1.全称：；
2.原理：；
3.条件：
①缓冲液：含有，目的是；
②模板：DNA双链；
③原料：4种，既作为又作为；
④酶：的酶；
⑤引物：种;4.引物
①概念：
②作用：
③修饰：
④选择：
5.计算
①复制n次，得到____个DNA，____条链，需要_________个引物，需要_________个引物1或2。
②复制n次，有____种DNA。
③复制____次，可得到等长片段。;1.重叠延伸PCR：①获得融合基因、②定点突变
2.大引物PCR（定点突变）
3.荧光定量PCR
4.RT-PCR（逆转录PCR）
5.反向PCR
6.巢式PCR
7.不对称PCR;;;;3’;3’;3’;;天然胰岛素B链部分氨基酸序列：;;;?;2.PCR定点突变技术——大引物;是在PCR扩增反应体系中加入荧光基团，通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。
常用的荧光探针如TaqMan探针，其两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。在PCR扩增过程中，TaqDNA聚合酶将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步?。
;报告荧光基团（R）
淬灭荧光基团（Q）;例2（2025·福建厦门·二模）实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入携带荧光基团的探针，利用荧光信号积累实时监测PCR反应进程的技术，可用于检测RNA病毒。提取病毒RNA，经逆转录形成cDNA，然后进行PCR，反应原理如下图所示。CT值表示PCR过程中荧光信号达到设定标准所需的循环次数。下列叙述错误的是（????）
A．探针与cDNA单链的结合遵循碱基互补配对原则
B．耐高温的DNA聚合酶具有催化探针水解的作用
C．CT值越小，意味着提取到的病毒RNA含量越低
D．若病毒发生单个碱基的突变，可能不会影响检测结果
;例题3实时荧光定量PCR简称qPCR，灵敏度高特异性好，是目前检测微小残留病变的常用方法。将标有荧光素的Taqman探针与待测样本DNA混合后，在变性、复性、延伸的???循环中，与待测样本DNA配对结合的Taqman探针被Taq酶切断，在特定光激发下发出荧光(如图所示)，随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值(该值与待测样本中目的基因的个数呈负相关)。下列有关叙述正确的是();
A．每个模板DNA分子含有2个游离的磷酸基团
B．做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成1种引物和1种Taqman探针
C．在反应过程中，需要细胞中的ATP为新链的合成提供能量
D．荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明含有的病变的概率越小;4.RT-PCR;例4：RT－PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，可利用此技术获取目的基因，具体过程如图所示，以下说法错误的是?(?);反向PCR是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段。实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有黏性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究。;5.反向PCR测定未知DNA区域;?;?;巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应（如图所示），使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为它们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低，巢式PCR的扩增特异更强。;例6为减少引物与模板之间的非特异性配对，人们对普通
PCR技术进行改良，发明了巢式PCR，原理是利用两套引物
进行两轮PCR扩增。首先利用第一对引物（外引物）对目