基因工程;考点;高频易错查落实;基因工程;核心点1——PCR技术与应用;【真题引领】1.(2020·北京，12)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（）
;(2)(经典高考题节选)设计引物时需要避免引物之间发生_____________，而造成引物自连。同理也要避免引物之间的互补。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同且____________的引物需要设定更高的复性温度。;【真题引领】2.（1）(2022·山东，25节选)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P和FLAG－PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或PΔ的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或PΔ的功能。
①为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是_________________________________________________________，为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______(填“3′端”或“5′端”)。
②PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图分析，出现该问题的原因是
;(2)引物用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如图所示，X为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是图中的;【真题引领】3.（2023山东.25）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
（1）与图甲中启动子结合的酶是____________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有________________________________________（答出2个结构即可）。
（2）构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物________________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的_____________（填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。
（3）重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了______________，条带2所检出的蛋白______________（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。;(2024·长沙高三模拟)PCR引物的3′端有结合模板DNA的关键碱基，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列。下列相关叙述错误的是（）
A.图中两条子链合成一定都是从5′端向3′端延伸
B.图示表示复性阶段，该过程的温度与引物的长短有关
C.用图示引物扩增5次后，可以产生22个目标产物
D.PCR每次循环都消耗引物和原料，在实验过程中需要及时补充;;小结：引物的数量计算;二、常用PCR技术“及原理;2.利用重叠延伸PCR技术构造融合基因;3.利用反向PCR技术扩增未知基因序列;例4.(不定项)(2024·长沙高三模拟)荧光定量PCR是一种定量计算待测样品的初始模板量的方法。在PCR反应体系中加入特异性的荧光探针，荧光探针可以掺入新合成的DNA链中，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，通过对扩增反应中的荧光强度进行实时检测，最后通过标准曲线定量计算初始模板量。如图为某荧光定量PCR的标准曲线。下列说法正确的是
A.一定范围内，荧光强度与扩增出的DNA量呈正相关
B.每个反应管内荧光探针的量相同
C.样品甲的初始模板量大于样品乙
D.荧光强度不再变化时PCR反应停止;5.“双脱氧法”基因测序
例5.(不定项)(2024·湖南，15)最早的双脱氧测序法是在PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸