国家开放大学 农业微生物学 模块一
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实验十三:培养基的制备及灭菌
一、目的与要求
1.目的
掌握培养基的制备原理和方法。
学会不同类型培养基的配制技术。
熟练掌握高压蒸汽灭菌锅等灭菌设备的操作方法，理解灭菌的原理和重要性。
2.要求
严格按照配方准确称量各种成分，确保培养基的质量。
规范操作灭菌设备，保证灭菌效果，避免杂菌污染。
认真记录实验过程和结果，培养严谨的科学态度。
二、实验原理
1.培养基制备原理
培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。一般含有水、碳源、氮源、无机盐和生长因子等营养物质，不同微生物对这些营养物质的需求比例和种类有差异，因此需根据目标微生物的特性来配制合适的培养基。
2.灭菌原理
灭菌是指采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。本实验采用高压蒸汽灭菌法，其原理是利用密闭的高压蒸汽灭菌锅，在密闭条件下，当水蒸气中含有大量热量时能提高温度，在103.4kPa（1.05kg/cm2）蒸汽压下，温度达到121.3℃，维持15-30分钟，可杀灭包括细菌芽孢和真菌孢子在内的所有微生物。
三、实验材料
1.药品试剂：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水等。
2.仪器设备：高压蒸汽灭菌锅、电子天平、量筒、烧杯、玻璃棒、锥形瓶、培养皿、试管、棉塞、牛皮纸、麻绳等。
四、实验方法与步骤
1.培养基的制备（以牛肉膏蛋白胨培养基为例）
（1）称量：按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、氯化钠放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。
（2）溶化：在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。
（3）调pH：在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7.4-7.6。反之，则用1mol/LHCl进行调节。
（4）分装：将配好的培养基分装入锥形瓶、试管或培养皿中。分装时注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装量根据需要而定，一般液体培养基分装至锥形瓶体积的1/3左右；固体培养基分装试管时，其装量不超过试管高度的1/5，灭菌后制成斜面；分装培养皿的量，一般以15-20mL为宜。
（5）包扎：分装完毕后，在锥形瓶瓶口上塞上棉塞，用牛皮纸包扎好；试管管口塞上棉塞后，8支为一扎，然后用牛皮纸包好；培养皿10套为一包，用牛皮纸包好。包扎好后，在纸上注明培养基名称、组别、日期等。
2.灭菌
（1）加水：向高压蒸汽灭菌锅内加入适量的水，使水面与搁架相平为宜。
（2）装载：将包扎好的培养基放入灭菌锅内，注意不要放得太挤，以免影响蒸汽流通和灭菌效果。
（3）加热排气：盖上锅盖，对称地旋紧螺旋，打开排气阀，加热使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀。
（4）灭菌：当锅内压力升至所需压力时（一般为103.4kPa，121.3℃），控制热源，维持此压力15-30分钟。
（5）降压冷却：灭菌时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋开螺栓，打开锅盖，取出培养基。
五、实验结果
1.培养基外观：制备的牛肉膏蛋白胨液体培养基呈澄清的淡黄色，无沉淀和杂质；固体培养基冷却后凝固良好，表面光滑，无气泡和裂纹。
2.无菌检查：将灭菌后的培养基置于37℃恒温培养箱中培养24-48小时，观察培养基表面及内部是否有菌落生长。结果显示，所有培养基均无杂菌生长，说明灭菌效果良好。
3.斜面培养基质量：分装于试管中的固体培养基经灭菌后制成斜面，斜面长度约为试管长度的1/2-2/3，斜面平整、光滑，适合微生物的生长和观察。
通过本次实验，我成功掌握了培养基的制备和灭菌方法，了解了培养基制备和灭菌的原理及操作要点，为后续的微生物实验打下了坚实的基础。