关于实验五质粒酶切质粒限制性内切酶消化酶切第1页，共29页，星期日，2025年，2月5日背景知识一、质粒图谱的阅读二、限制性内切酶第2页，共29页，星期日，2025年，2月5日第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。Ampr水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。tetr可以阻止四环素进入细胞。camr生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活hygr使潮霉素β失活。一、质粒图谱的阅读第3页，共29页，星期日，2025年，2月5日第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。第五步：是否含有表达系统元件，即：启动子——核糖体结合位点——克隆位点——转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体的。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。第4页，共29页，星期日，2025年，2月5日农杆菌复制起始位点大肠杆菌复制起始位点加尾信号，终止位点潮霉素抗性基因多克隆位点终止子加尾信号绿色荧光蛋白基因第5页，共29页，星期日，2025年，2月5日二、限制性内切酶1)概念2)命名原则3)类型4)基本特性及用途5)影响核酸限制性内切酶活性的因素6)Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项第6页，共29页，星期日，2025年，2月5日1)概念限制性核酸内切酶(restrictionednonuclease)是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA的内切核酸酶（endonuclease)的总称。至2006年2月共发现3773种限制性内切酶，I、II、III型各有68、3692、10种，甲基化指导的3种，商品化的609种，II型中共有223种特异性。第7页，共29页，星期日，2025年，2月5日2)命名原则1973年H.O.Smith和D.Nathams首次提出命名原则，1980年Roberts在此基础上进行了系统分类①限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名(genus)；第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species)。②第四个字母代表宿主菌的株或型(strain)。③若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。属名种名株系Haemophilusinfluenzaed流感嗜血杆菌d株HindⅡHindⅢ同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶第8页，共29页，星期日，2025年，2月5日3)类型据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三类。第9页，共29页，星期日，2025年，2月5日4)基本特性及用途Ⅱ限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，它以核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5′端为P，3′端为OH，识别序列一般为4～6个碱基对，通常是反转录重复顺序，具有180°的旋转对称性即迴文结构。Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口。5′粘性末端3种切口3′粘性末端平头末端第10页，共29页，星期日，2025年，2月5日第11页，共29页，星期日，2025年，2月5日第12页，共29页，星期日，2025年，2月5日第13页，共29页，星期日，2025年，2月5日Ⅱ限制性核酸内切酶的主要用途①在特异位点上切割DNA，产生特异的限制性酶片段。②建立DNA分子的限制酶图谱。③构建基因文库。④用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组。⑤改建质粒。第14页，共29页，星期日，2025年，2月5日5)影响核酸限制性内