石蜡切片和冰冻切片的比较名称石蜡切片冰冻切片操作步骤繁琐简单抗原活性可能会破坏组织的抗原性完好地保存各种抗原活性及酶类切片厚薄薄厚优点薄，观察结构清晰；连续切片抗原活性好，适合免疫组化；简便操作缺点做免疫组化时部分需抗原修复不能连续切片；不能较薄切片第30页，共78页，星期日，2025年，2月5日细胞通透脱蜡、复水封闭抗原修复封片、镜检二抗孵育一抗孵育浸洗浸洗DAB显色（3）免疫酶法第31页，共78页，星期日，2025年，2月5日脱蜡和复水：这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。第32页，共78页，星期日，2025年，2月5日抗原修复：由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。一般用微波修复中火6min*4次，效果不错。注意微波修复后自然冷却30min左右（只要你觉得修复液的温度达室温即可）。第33页，共78页，星期日，2025年，2月5日细胞通透：目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用TritonX-100、蛋白酶k等通透液。如TritonX-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。第34页，共78页，星期日，2025年，2月5日血清封闭：组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。一般室温30min。但也要防止封闭过度。第35页，共78页，星期日，2025年，2月5日一抗和二抗浓度和孵育时间：一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间、温度和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度。但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。建议一抗反应在4度最佳，反应温和，但时间最好不超过16~24h。第36页，共78页，星期日，2025年，2月5日切片清洗（浸洗、冲洗和漂洗）：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。注意：①单独冲洗，防止交叉反应造成污染。②温柔浸洗，防止切片的脱落。③冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。④PBS的pH和离子强度的使用和要求。建议pH在7.4-7.6浓度为0.01M。（中性及弱碱性条件（pH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）第37页，共78页，星期日，2025年，2月5日DAB显色：背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由DAB孵育条件决定。DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗；DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色背景，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。第38页，共78页，星期日，2025年，2月5日产生组织切片非特异性染色1、抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。2、一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。3、血清封闭时间不够，这需要通过延长动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；4、DAB孵育时间过长或浓度过高；5、PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗/二抗孵育后的浸洗尤为重要；6、标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异