微专题11PCR技术与电泳相关问题
【知识必备】
题型一PCR技术的相关计算
1.PCR扩增过程中的循环图示与规律
2.PCR中的数量关系
复制次数
1
2
3
n
DNA分子数
2
4
8
2n
含其中一种引物的数量
1
3
7
2n－1
同时含两种引物的数量
0
2
6
2n－2
共消耗引物的数量
2
6
14
2n＋1－2
[典例1](2024·河北石家庄统考)实时荧光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT－PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是()
A.做RT－PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针
B.RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增
C.若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒
D.病毒的检测还可以检测病毒引发产生的抗体，其原理是抗原—抗体杂交
答案C
解析PCR需要根据cDNA的核苷酸序列合成引物，同时RT—PCR还需要探针与待测样本DNA混合，故需要根据cDNA的核苷酸序列合成探针，A正确；PCR扩增必须以DNA为模板，RNA不能作为PCR扩增的模板，所以需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增，B正确；若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者极有可能感染了病毒，C错误；RNA病毒的检测方法有：①RNA检测，即检测病毒的遗传物质RNA；②特异性抗原蛋白检测，即检测病毒表面的一种糖蛋白；③特异性抗体检测，即检测感染者体内通过免疫反应所产生的某种抗体，后两种方法的原理是抗原—抗体杂交，D正确。
[典例2](2024·山东淄博模拟)定点诱变技术是近年来生物工程研究中发展迅速的一个领域。通过定点诱变可以在体外改造目的DNA分子，进而研究基因的表达以及蛋白质的结构与功能之间的关系。经典的大引物PCR定点诱变技术成为基于PCR的定点诱变技术中应用最普遍的方法，操作过程如图甲。研究者欲改造某基因并将其导入大肠杆菌的质粒中保存，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位点，结构如图乙。回答下列问题：
(1)利用大引物PCR进行定点诱变需要进行两轮PCR(PCR1和PCR2)，在PCR1中，至少需要个循环才能获得相应的大引物模板。在PCR2中，要获得带有诱变点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的(填“①”或“②”)。
(2)为实现质粒和改良基因的高效连接，选用限制酶XmaⅠ而不选用限制酶SmaⅠ的原因是_________________________________________________________
__________________________________________________________________。
为将改良基因构建在质粒上，还需要等酶。
(3)在构建改良基因表达载体时，有的质粒含有改良基因，有的质粒为空白质粒，将含上述组件的溶液加入大肠杆菌菌液中，适宜温度下培养一段时间后，再将菌液涂布在含氨苄青霉素和的平板上。一段时间后，在培养基上出现白色和蓝色两种菌落，其中白色菌落含有重组质粒，判断的依据是________________
___________________________________________________________________。
答案(1)2②(2)SmaⅠ的酶切末端为平末端，无法与改良基因上的黏性末端连接BglⅡ、DNA连接酶(3)β－半乳糖苷构建改良基因重组质粒时破坏了LacZ基因，含该质粒的大肠杆菌不能分解β－半乳糖苷产生蓝色物质，菌落为白色
解析(1)由图可知，大引物的两条链均带有突变位点，进行第一轮循环，得到的DNA有一个不含突变位点，另一个DNA有一条链含有突变位点，进行第二轮循环，即可得到DNA有两个不含突变位点、一个含一个突变位点和一个两条链均含突变位点的DNA，即大引物，所以至少需要经过两个循环才能获得相应的大引物模板；在PCR2中，由于DNA聚合酶只能从子链的3′端连接单个脱氧核苷酸，因此从大引物和目的基因的结合位点分析，要获得带有诱变点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的②链。(2)根据SmaⅠ的酶切位点，如果选择SmaⅠ，则获得的是平末端，无法与改良基因上的黏性末端连接；从各种限制酶的酶切位点分析，除使用XmaⅠ外，还需使用BglⅡ切出相应黏性末端与改良基因CTAG一侧进行连接，同时需要用DNA连接酶构建基因表达载体。(3)因LacZ基因编码的酶能分解β－