专题突破10综合PCR的基因工程问题
课标要求
阐明PCR的原理、反应条件、反应过程；用PCR扩增DNA片段并完成电泳鉴定。
考情分析
引物的选择和设计、PCR扩增结果的电泳鉴定与分析、PCR的应用
2024·湖南·T152024·山东·T32024·黑吉辽·T7
2023·江苏·T222022·辽宁·T122022·江苏·T24
类型一PCR引物碱基序列的设计
1．土壤盐渍化影响水稻生长发育。将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱水稻新品种，过程①PCR扩增OsMYB56需要添加引物，应选用的引物组合为()
A．5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TCTGTTGAAT－3′
B．5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TAAGTTGTCT－3′
C．5′－ATTCAACAGA－3′和5′－ATCATCCAAG－3′
D．5′－ATTCAACAGA－3′和5′－GAACCTACTA－3′
2．(2021·湖北，16)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是()
A．增加模板DNA的量
B．延长热变性的时间
C．延长延伸的时间
D．提高复性的温度
3．以下两组引物设计的均不合理的原因是____________________________________________
_______________________________________________________________________________。
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物设计的优劣对PCR反应的效率和特异性影响很大，引物设计的原则主要包括：
(1)引物长度一般为20～30bp，可定位目的基因并为子链的延伸提供3′端。
(2)引物中CG含量要适宜，CG含量越高，复性(退火)温度越高，产物特异性越高。
(3)引物自身、引物之间不能有连续4个碱基互补，否则引物会折叠成发夹结构或二聚体，影响引物与模板的复性结合。
(4)引物的5′端可以修饰(添加酶切位点、引入突变序列)，但3′端不可修饰(与模板DNA配对)。
类型二利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物
4．(2024·黑吉辽，7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是()
A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
1．DNA电泳鉴定中的“两液两剂”
两液：电泳缓冲液与凝胶载样缓冲液。电泳缓冲液能维持整个电泳体系的pH稳定，提供导电介质；凝胶载样缓冲液可影响物质的电泳迁移速率，主要用于样品的稀释和保护，同时通过指示剂指示样品在凝胶中的位置。
两剂：核酸染料与指示剂。核酸染料是用来染色DNA或RNA分子的一种化学物质，以便在紫外灯下观察和检测核酸条带，最常用的核酸染料是溴化乙锭。最常用的指示剂是溴酚蓝，它在电泳凝胶中的迁移速度与DNA或RNA分子的迁移速度相近。在电泳过程中，溴酚蓝通常位于样品的前沿，形成一个明显的蓝色条带，这有助于实验者判断电泳是否完成，以及何时停止电泳。
2．DNA迁移速率的影响因素
(1)凝胶浓度：凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，DNA迁移受到的阻力越大，速率越慢。
(2)DNA分子的大小：DNA的分子量越大，迁移速率越慢。
(3)DNA分子的构象：三种构象的质粒在琼脂糖凝胶电泳的前后顺序为环形超螺旋(DNA两条链都是完整的质粒)线形开环(DNA双链断了一条成为松弛的环)。
类型三利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式——正向连接和反向连接
5．(2019·江苏，33节选)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是______。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是________________。
检测目的基因在受体细胞内是否稳定存在是基因工程操作的重要步骤，可以借助载体上的标记基因、PCR技术和核酸分子杂交技术等方法鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。在实际操作中，PCR技术不仅可以精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因，还可以通过引物的巧妙设计鉴定目的基因的连接方式。
类型四利用PCR技术引导基因定点突变及融合基因的重组构建——重叠延伸PCR
6．水蛭素是一