（二）影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素⑴外源基因的剂量外源基因拷贝到高拷贝数的表达质粒上，总体表达水平提高⑵外源基因的表达效率与启动子强弱，核糖体结合位点的有效性，SD序列与起始密码的间距，密码子的组成等都影响其表达效率第30页，共52页，星期日，2025年，2月5日⑶表达产物的稳定性⑷细胞代谢负荷宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开细胞的生长和外源基因的表达分成两个阶段⑸工程菌的培养条件优化工程菌培养条件，提高基因表达水平第31页，共52页，星期日，2025年，2月5日（三）真核基因在大肠杆菌中的表达形式⑴以融合蛋白的形式表达药物基因以原核多肽和真核蛋白结合在一起称融合蛋白。优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳定，易实现高效表达；缺点：只能作抗原用。第32页，共52页，星期日，2025年，2月5日⑵以非融合蛋白的形式表达药物基因非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。优点：保持原有蛋白活性；缺点：易被蛋白酶破坏。第33页，共52页，星期日，2025年，2月5日⑶分泌型表达蛋白药物基因优点：在周质中稳定，有活性，不含蛋氨酸残基；缺点：产量不高，信号肽不被切割。第34页，共52页，星期日，2025年，2月5日三、酵母中的基因表达（一）表达载体酵母载体是可以携带外源基因在酵母细胞内保存和复制，并随酵母分裂传递到子代细胞的DNA或RNA单位。1.载体的复制序列①酵母附加体质粒（yeastepisomalplasmid，Yep类）②酵母复制型质粒（yeastreplicationplasmid，Ypp类）③酵母着丝粒质粒（yeastcentromericplasmid，YCp类）④酵母整合型质粒（yeastinteegrativeplasmid，YIp类）第35页，共52页，星期日，2025年，2月5日2.克隆载体酵母质粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的，只有在最后阶段才转入酵母中，这就要求酵母载体也同时具有在大肠杆菌中复制和增殖的能力。3.表达载体将酵母菌的启动子和终止子等有关控制序列引入上述载体的适当位点后，就构成了酵母菌的表达载体。又分为普通表达载体和精确表达载体第36页，共52页，星期日，2025年，2月5日①普通表达载体，只能方便地引入外源基因并进行表达，对表达产物的组成，特别是对其N末端氨基酸是否增减并无严格要求。②精确表达载体，要求在启动子或信号肽编码序列的适当部位有内切酶点，以利于接入外源基因，并使他在表达加工后N末端氨基酸序列与天然产物相同，既无多余的氨基酸，也无缺失的氨基酸。第37页，共52页，星期日，2025年，2月5日第1页，共52页，星期日，2025年，2月5日用途：主要用于癌症、人类免疫缺陷病毒性疾病、心血管疾病、糖尿病、贫血和许多遗传疾病的治疗。获取方式：生化提取基因工程表达成本高产量低质量难以保证成本低产量高活性强性质优实例：人生长激素（侏儒症）50具新鲜尸体脑下垂体中提取采用基因工程从1～2升细菌培养液中提取获得=第2页，共52页，星期日，2025年，2月5日1982年世界上第一个基因工程药物―重组人胰岛素获准生产销售，至今已有100多个生物技术药物上市;促红细胞生成素（EPO）以全球销售额38亿美元的业绩，居全球最畅销10种药物的第6名；1989年我国第一个拥有自主知识产权的基因工程药物--重组人干扰素（IFN–α1b）上市以来，目前，世界上销售额排前10位的生物技术药物我国已能生产8种。国际生物医药产业发展动态第3页，共52页，星期日，2025年，2月5日第一节概述生物技术的核心就是基因工程，20世纪70年代基因工程诞生,最先应用在医药科学领域。传统生物药物由于来源及制备上的困难、价格等因素的影响，此外在制备过程可能受到的病毒、衣原体、支原体等的感染等问题（如：生长激素抑制素1mg传统法：10万只羊的下丘脑，现：10L大肠杆菌培养液，0.3美元/mg；尿激酶从男性尿中提取；胎盘丙种球蛋白从胎盘中提取。第4页，共52页，星期日，2025年，2月5日应用基因工程技术可十分方便且有效地解决传统生物制药所遇到的问题如今，癌症、病毒性疾病、心血管疾病以及内分