关于单基因病致病基因的鉴定第1页，共29页，星期日，2025年，2月5日*每一片代表一个基因，有规律的组合在一起形成一条染色体第2页，共29页，星期日，2025年，2月5日*第3页，共29页，星期日，2025年，2月5日*第4页，共29页，星期日，2025年，2月5日*第5页，共29页，星期日，2025年，2月5日*功能克隆：从蛋白质着手进行基因克隆的策略。定位克隆：在蛋白质产物未知的情况下进行基因克隆的策略。蛋白酶消化、分离氨基酸序列测定设计合成寡核苷酸筛选cDNA文库不同多肽片段家系资料连锁分析获得差异片段染色体异常筛选cDNA文库克隆全长基因精细定位消减克隆第6页，共29页，星期日，2025年，2月5日*第7页，共29页，星期日，2025年，2月5日*第一节功能克隆通过基因的功能（编码蛋白）而不依赖定位的信息来分离基因的策略第一个疾病致病基因通过此策略发现范例：镰状细胞贫血的β-珠蛋白基因苯丙酮尿症的苯丙氨酸羟化酶基因第8页，共29页，星期日，2025年，2月5日*流程示意图第9页，共29页，星期日，2025年，2月5日*甲型血友病遗传方式：XR发病率：1/10,000（男）病因：FⅧ基因遗传性缺陷(缺失、点突变、插入、重复、倒位)?基因定位：Xq28?基因全长186kb，含26个外显子?临床表现：外伤后出血不止，关节血肿第10页，共29页，星期日，2025年，2月5日*☆FⅧ因子基因的功能克隆功能克隆是从蛋白质着手进行基因克隆的策略。Ⅷ因子多肽不同多肽片段蛋白酶消化分离氨基酸序列测定设计合成寡核苷酸筛选cDNA文库第11页，共29页，星期日，2025年，2月5日*通过动物模型鉴定疾病基因第12页，共29页，星期日，2025年，2月5日*第13页，共29页，星期日，2025年，2月5日*第14页，共29页，星期日，2025年，2月5日*第二节定位克隆基于染色体异常的基因定位连锁分析确定致病基因第15页，共29页，星期日，2025年，2月5日*基于染色体异常的基因定位第16页，共29页，星期日，2025年，2月5日*连锁分析第17页，共29页，星期日，2025年，2月5日*确定致病基因突变筛查：在家系中该突变与表型共分离是最主要的证据表型拯救：有些导致疾病的突变通常引起基因功能的丧失，而且其表型是可逆的。如果从一个患者的细胞中能够发现基因突变的表型，我们就可以检测转染了候选基因野生型等位基因的表达载体是否能够“拯救”突变并恢复正常的表型建立疾病的小鼠模型：如果能够在某一家系中确定一个致病基因，但又无法利用更多的无关患者来验证，通过构建小鼠模型来验证。对于功能丧失性突变导致的表型可以通过制作基因敲除（knock-out）小鼠。对于功能获得性突变导致的表型或者突变效应不清楚的表型，可以制作突变基因敲入（knock-in）模型第18页，共29页，星期日，2025年，2月5日*第19页，共29页，星期日，2025年，2月5日*Duchenne型肌营养不良（Duchennemusculardystrophy,DMD）遗传方式：XR发病率：1/3400（男）临床表现：双下肢肌无力、Gower征、腓肠肌假性肥大、进行性肌萎缩（一般≤20岁）。病因：DMD基因突变，→抗肌萎缩蛋白（dystrophin）↓。基因定位：Xp21.23，全长2,400kb，含79个外显子，是已知最大的致病基因。第20页，共29页，星期日，2025年，2月5日*Gower综合征第21页，共29页，星期日，2025年，2月5日