关于单克隆抗体的制备(2)第1页，共27页，星期日，2025年，2月5日什么是单克隆抗体？1、单克隆抗体（monoclonalantibodies,mAb）：由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。第2页，共27页，星期日，2025年，2月5日单克隆抗体制备原理-----第3页，共27页，星期日，2025年，2月5日单克隆抗体杂交瘤技术基本流程第4页，共27页，星期日，2025年，2月5日在培养基中加入氨基嘌呤，收集增殖细胞！3种杂交细胞：①B-B融合细胞、②杂交瘤细胞③瘤-瘤融合细胞未融合的细胞：④单个的B细胞、⑤单个的骨髓瘤细胞这五种细胞中，①④没有分裂能力，逐渐衰老死亡；③⑤的DNA复制只有D途径，加入氨基嘌呤后，使D合成途径阻断，也逐渐衰老死亡，但②的DNA复制有D、S两条途径，虽然D途径被氨基嘌呤阻断，但是还可以通过S途径进行DNA的复制，使细胞有分裂能力。第5页，共27页，星期日，2025年，2月5日第6页，共27页，星期日，2025年，2月5日单克隆抗体的制备步骤一：免疫原的制备：1：完全抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等分子量大于5000Da生物物质2：半抗原：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于5000Da物质3：半抗原需与BSA、OVA等载体交联后成完全抗原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体第7页，共27页，星期日，2025年，2月5日
单克隆抗体的制备步骤
免疫动物的选取：6-8周龄的雌性，纯系的BalB/C。免疫原：细胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加强免疫。?免疫程序：免疫剂量、免疫途径、免疫次数、间隔时间、佐剂的选择。二.动物免疫第8页，共27页，星期日，2025年，2月5日单克隆抗体的制备步骤抗原接种第9页，共27页，星期日，2025年，2月5日
单克隆抗体的制备步骤
三：细胞融合
细胞融合的基本原理是免疫原刺激小鼠产生特异性的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞,在PEG
融合剂或是电刺激或是激光刺激来促使细胞融合形成杂交瘤细胞。蹄选得到的杂交瘤
细胞继承了B淋巴细胞产生特异性抗体以及骨髓瘤细胞无限传代的特性,并以此进行
大规模的细胞培养,生产出大量的特异性良好的单克隆抗体,为快速诊断试剂的研制
奠定了坚实的基础。
第10页，共27页，星期日，2025年，2月5日所需试剂：
培养液：RPM1640培养液，DMEM培养液，HAT培养液，HT培养液细胞融合剂：PEG:分子量4000的PEG是最常用的细胞融合剂作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同第11页，共27页，星期日，2025年，2月5日
单克隆抗体的制备步骤
三.细胞融合步骤●·1：饲养细胞为小鼠的腹腔巨噬细胞。第12页，共27页，星期日，2025年，2月5日单克隆抗体的制备步骤1：将脾细胞和骨髓瘤细胞5:1混合，加DM液，混匀2：离心，弃上清，磨成糊状3：将离心管置于37°温水，摇动；边滴加PEG14504：加入DM液5：离心，弃上清6：HAT重悬后加入96孔板，放入CO2培养箱7：五天后，15%血清的HAT补液8：八天后，彻底换15%血清DM液三.细胞融合第13页，共27页，星期日，2025年，2月5日ELISA方法筛选阳性孔单克隆抗体的制备步骤四.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选第14页，共27页，星期日，2025年，2月5日阳性孔单克隆抗体的制备步骤用多孔细胞培养板培养，稀释度要保证每个孔内不多于一个细胞。抗原抗体杂交法检