（3）柯斯质粒包装条件由于只有在被作用的?DNA分子具有两个cos位点，而且它们之间距离保持在36.4～51kb的条件下，Ter体系才能对它发生作用。据此推断：柯斯质粒是不能作为包装体系的，因为它只有一个cos位点。因此：柯斯质粒只有在同适当大小的外源DNA片段重组成具有两个cos位点而且相距达36.4～51kb之间时，才能被包装。第23页，共37页，星期日，2025年，2月5日利用Cos质粒进行克隆第24页，共37页，星期日，2025年，2月5日（四）使用cosmid载体的基本程序 利用cosmid的质粒性质，可按质粒操作转化受体细胞 利用cosmid的λ噬菌体性质→转导受体细胞（下图）第25页，共37页，星期日，2025年，2月5日三、M13噬菌体克隆载体（单链丝状噬菌体载体） 第26页，共37页，星期日，2025年，2月5日含复制起始位点及可插入外源DNA的位点（一）M13DNA——环状单链DNA分子（“+”链DNA）大小：6.4kb结构：10个区基因间隔区（IS区）第27页，共37页，星期日，2025年，2月5日（二）M13DNA复制和M13噬菌体增殖M13DNA“+”链进入雄性大肠杆菌→合成“-”链→产生双链M13DNA（复制型DNA或RF-DNA）→按环状双链DNA方式复制，同时以“+”链DNA为模板转译包装蛋白→RF-DNA达200拷贝时，单链DNA特异结合蛋白与“+”链结合而阻断合成“-”链→结果只能以“-”链为模板合成“+”链→“+”链DNA被包装蛋白包装成新的M13噬菌体→挤出受体细胞→受体细胞不被溶菌。第28页，共37页，星期日，2025年，2月5日关于基因克隆载体(3)第1页，共37页，星期日，2025年，2月5日第二节病毒（噬菌体）克隆载体病毒基本结构：DNA（或RNA）+外壳蛋白噬菌体:感染细菌的病毒分类（根据病毒与宿主的关系）温和性病毒： 溶原性增殖→构建病毒载体 烈性病毒： 溶菌性增殖→改造后第2页，共37页，星期日，2025年，2月5日λ噬菌体的电子显微镜照片一、λ噬菌体克隆载体第3页，共37页，星期日，2025年，2月5日λDNA+外壳蛋白1、λDNA(48.5kb)噬菌体中：线性宿主细胞：环状(cos位点)（一）λ噬菌体性质第4页，共37页，星期日，2025年，2月5日在噬菌体内呈线性双链DNA分子(48502bp)在两端各有12个碱基组成的5’单链互补粘性末端(Cohesiveend)；进入宿主细胞后，粘性末端连接形成环状分子(Cos位点)。（DNA连接酶）第5页，共37页，星期日，2025年，2月5日2、λ噬菌体基因组有基因61个以上 J与N、P与Q之间为非必需序列第6页，共37页，星期日，2025年，2月5日迄今已经定位的λ噬菌体基因至少有61个，其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的调控（必需基因）；另一部分基因则被称为非必需基因；当它们被外源基因取代后，不影响噬菌体的生命周期。由外源基因取代非必需基因所形成的重组噬菌体DNA，可以随寄主细胞一起被复制和增殖。第7页，共37页，星期日，2025年，2月5日3、限制性核酸内切酶位点:56种4、λ噬菌体的生长途径 溶菌生长途径 溶原生长途径→宿主合成int基因产物→λ-DNA整合到染色体DNA上→某种胁迫条件下→合成six基因产物→λ-DNA脱离细菌染色体→溶菌第8页，共37页，星期日，2025年，2月5日（二）构建依据1、λ噬菌体是一种温和噬菌体2、能承载较大的外源DNA片段 野生型λDNA头部可包装约36.4～51kb(自身的75%～105%)，且约有20kbλDNA可缺失（生长非必需）3、在λDNA上有多种限制性内切酶位点第9页，共37页，星期日，2025年，2月5日（三）构建的基本策略与技术路线策略:切去部分非必需区删掉多余的限制性内切酶位点插入选择性标记基因建立体外包装系统第10页，共37页，星期日，2025年，2月5日技术路线1、用限制性酶切去非必需区，抹去多余识别位点 选定一种酶，以gtWES–λβ为例，EcoRI （48.5kb）λDNAEcoRI6个片段第11页，共37页，星期日，2025年，2月5日B片段是λ噬菌体生长非必需的；C片段缺失可阻断溶原生长途径，但不影响溶菌途径；E