2.培养方法1）饲养细胞层法用X射线或紫外线照射细胞（106），抑制细胞分裂，但不破坏细胞代谢，将其清洗，植板在软琼脂培养基上，此平板称饲喂层，然后将未照射处理的原生质体铺在饲喂层上。
特点
以一种植物细胞制成的平板，支持另一种植物原生质体的生长。饲喂层没有种的特异性。烟草原生质体植板密度低于104时，一般不能分裂，用此方法，植板密度可低至10-100。第30页，共63页，星期日，2025年，2月5日2种类型的活跃代谢和正在分裂的原生质体
混合在液体培养基中一起培养。
用于某些物种原生质体或杂种细胞的培养。
条件
2个物种原生质体间能发生有效的互馈；
其产生的愈伤组织形态上能彼此区分。2）共培养法第31页，共63页，星期日，2025年，2月5日3）Cuprak微滴法高国楠（1977）及Gleba（1978）设计特别培养皿培养单个原生质体及其再生的细胞。两室大的内室：很多小穴，加入原生质体悬浮液（0.25-0.5μl）；小的外室：注入无菌水，保持培养皿内湿度。可进行单个原生质体培养。第32页，共63页，星期日，2025年，2月5日六、细胞壁的形成培养2-4天，原生质体失去其特有的球型外观，这是再生新壁的象征。研究认为，旋花科植物原生质体只有在外源供应一种易于代谢的碳源（蔗糖）时，细胞壁才能再生。培养基中若存在电解质渗透压调节剂时会抑制壁的再生。壁的形成与细胞分裂有直接关系，凡是不能再生壁的原生质体就不能进行正常的有丝分裂。愈伤组织形成后，转入不含渗透压调节剂的培养剂中，其培养及植株再生与一般组织培养方法相同。第33页，共63页，星期日，2025年，2月5日原生质体培养的程序
第34页，共63页，星期日，2025年，2月5日一、原生质体融合意义
原生质体融合也称体细胞杂交，
即，分离下来的不同亲本杂交的原生质体，
在人工控制下互相融合成一体。
自然条件下，原生质体自然融合频率极低，
必须加以一定的方法诱导，才能促进原生质体的融合。第三节原生质体融合第35页，共63页，星期日，2025年，2月5日原生质体融合◆打破了种间界限（生殖隔离），使基因交流扩大范围；◆克服有性杂交特别是远缘杂交的不亲和性；◆扩大了遗传变异及种质资源的范围。原生质体融合的意义第36页，共63页，星期日，2025年，2月5日甘薯原生质体融合植株第37页，共63页，星期日，2025年，2月5日1.化学法融合1）无机盐诱导融合1909年，Kuster证实，低渗NaNO3处理可诱导发生质壁分离表皮细胞2个原生质体融合。缺点异核体形成频率不高，尤其是对于高度液泡化的叶肉原生质体。二、原生质体融合方法第38页，共63页，星期日，2025年，2月5日Carlson等（1972）获得第一个体细胞杂种第39页，共63页，星期日，2025年，2月5日2）高pH-高钙离子诱导融合Keller和Melcher（1973年）强碱性的高浓度钙离子（pH，10.5；钙离子，50mmol/L）37℃处理30min，两个品系烟草叶肉原生质体很容易融合。1977年，获得烟草种间和种内体细胞杂种。对矮牵牛效果也很好，但对有些物种，高pH可能有毒。第40页，共63页，星期日，2025年，2月5日高国楠等（1974）提出，现被广泛采用。
滴150μl混合双亲的原生质体悬浮液于载体玻片上，形成一层薄层;
吸取PEG融合诱导液（28-58%，分子量1500-6000）450μl，
使其逐渐与原生质体接触，促使原生质体相粘连；
培养基进行清洗。
高Ca2+-高pH溶液清洗，
可提高原生质体融合频率。3）聚乙二醇（PEG）诱导融合第41页，共63页，星期日，2025年，2月5日优点▲采用聚乙二醇作为融合剂时，异核体形成的频率很高，可重复性很强；▲对大多数细胞类型来说毒性很低；第42页，共63页，星期日，2025年，2月5日洋葱烟草第43页，共63页，星期日，2025年，2月5日将原生质体悬浮液离心，去上清，用电击液（10%甘露醇，0.1mmol/L醋酸钙，0.5mmol/L醋酸镁）悬浮，置于融合小室；在电融合仪的交变电场作用下，原生质体彼此靠近，紧密接触，在两极间排成串珠状。给予瞬间的高强度电脉冲，质膜发生可逆性电激穿，导致融合。电融合法的优点（与化学融合法相比）▲简单、迅速、效率高；▲经融合处理后没有中毒反应；