2.WesternBlot基本原理蛋白质混合样品经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）后分离为不同的条带，其中含有能与特异性抗体相结合的待检测的蛋白质（抗原蛋白）。将PAGE胶上的蛋白条带转移到硝酸纤维素膜(nitrocellulosefiltermembrane，NC膜)，此过程称为印迹，以利于随后检测反应的进行。然后，将NC膜与抗体一起孵育，使抗体（一抗）与待检测的抗原决定簇结合（电泳分离的特异性蛋白条带），再与荧光素、酶或核素标记的二抗反应，即可检测出样品中的待测抗原并能对其定量。第31页，共70页，星期日，2025年，2月5日
Westernblot原理
第八节口腔免疫学研究的主要方法第32页，共70页，星期日，2025年，2月5日Anode-内槽缓冲液带有负电荷，与凝胶顶部接触外槽中缓冲液带有正电荷，与凝胶底部接触Cathode+带有负电荷的蛋白质从上到下运动（负极到正极），分开电泳进程可以根据前沿指示剂来确定，等其跑到底部上面1cm左右即可停止电泳小分子量蛋白跑的比较快.蛋白根据分子量大小分开蛋白质带有负电荷，因此电泳时可以从负极向正极移动标本加入到上样孔中第33页，共70页，星期日，2025年，2月5日第34页，共70页，星期日，2025年，2月5日3.WesternBlot操作流程蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色第35页，共70页，星期日，2025年，2月5日
常用仪器
第36页，共70页，星期日，2025年，2月5日
4.相关应用
基础研究：目的蛋白的表达特性分析目的蛋白与其它蛋白的相互作用目的蛋白的组织定位目的蛋白的表达量分析???第37页，共70页，星期日，2025年，2月5日临床：在艾滋病病毒感染中，根据出现显色线条的位置可以判断有无针对病毒的特异性抗体，以此法作为确诊试验。使用印迹抗原来测定各种病人的抗体谱已经直接作为临床免疫检验的手段，被称之为确认试验的“金标准”。?第38页，共70页，星期日，2025年，2月5日5.口腔应用实例基质金属蛋白酶-28（MMP-28）在口腔扁平苔藓中的表达。取口腔扁平苔藓患者口腔黏膜，所取新鲜标本立即置于液氮中保存。将组织迅速加入预冷的裂解液中，充分剪碎后，超声波细胞粉碎机进一步震碎细胞，置于冰上裂解30min，4℃离心取上清，置于-20℃保存。采用改良Lowry法测定蛋白浓度。第39页，共70页，星期日，2025年，2月5日取蛋白分别经10%SDS、5%PAGE凝胶电泳后，抗原转至NC膜。放入5%脱脂奶粉中封闭，PBS洗膜。加入一抗（鼠抗人MMP-28多克隆抗体）4℃过夜，洗涤后加入二抗（兔抗鼠IgG）37℃下孵育1h，DAB显色，PBST漂洗，密度扫描并拍照。对MMP-28表达与OLP临床参数进行相关性分析。第40页，共70页，星期日，2025年，2月5日为什么要作蛋白质印迹实验？
研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存在样品当中蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样品中，如疾病和正常的样品之间的表达差异性。小结第41页，共70页，星期日，2025年，2月5日四、流式细胞术流式细胞术概述流式细胞仪主要构造和基本工作原理流式细胞仪分析数据常见图形流式细胞术常规检测时的样本制备流式细胞术的应用口腔应用举例第42页，共70页，星期日，2025年，2月5日
1.流式细胞术概述流式细胞术（FlowCytometry，FCM）是利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒通过荧光标记进行多参数、快速的定量分析和分选的技术，目前已在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科的科研和临床广泛应用。流式细胞仪（FlowCytometer，FCM)是集合光电子物理，光电测量技术，计算机技术，细胞荧光化学，抗体技术等现代高科技技术为一体的细胞测量和分析仪器。第八节口腔免疫学研究的主要方法第43页，共70页，星期日，2025年，2月5日流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。流式细胞术的特点细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定性定量第44页，共70页，星期日，2025年，2月5日采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分