第1页，共31页，星期日，2025年，2月5日一.核酸的分离，提纯和定量测定（一）DNA的分离提纯真核生物DNA与蛋白质的复合物（DNP）溶于水和浓盐溶液，但不溶于0.14mol/L盐溶液，用苯酚或氯仿使蛋白质变性，DNA溶于上清液。在十二烷基硫酸钠（SDS）存在下用蛋白酶消化细胞，再用苯酚和氯仿除去蛋白酶，用RNase除去RNA，操作在低温下进行，防止过酸，过碱，或机械振荡，可得高质量的DNA。第2页，共31页，星期日，2025年，2月5日（二）RNA的分离提纯RNA易被广泛存在的RNase水解，所有器皿与溶液都要经过处理除去RNase，在破碎细胞的同时应使RNaes失活，在实验反应体系中要加RNaes的抑制剂。目前常用的分离方法——为釽盐/氯化铯密度梯度离心（RNA密度1.89，DNA密度-1.71，蛋白质密度1.33）。另一为酸性釽盐/酚/氯仿法。第3页，共31页，星期日，2025年，2月5日（三）核酸含量的测定法利用碱基，糖和磷酸基进行测定。紫外分光光度法：利用碱基260nm紫外吸收测定核酸含量。定磷法（钼蓝比色）：浓硫酸水解核酸之磷酸，酸性条件下磷酸与钼酸形成磷钼酸，用还原剂还原磷钼酸为钼蓝，660nm比色测定含量。定糖法RNA：核糖与盐酸共热生成糖醛，然后与地衣酚生成鲜绿色化合物，670nm比色测定含量。DNA：脱氧核糖与二苯胺共热生成蓝色化合物，595nm比色测定含量。第4页，共31页，星期日，2025年，2月5日生物组织冷的稀酸抽提酸溶性物质残留物有机溶剂抽提脂类物质残留物碱法热酸法冷酸法碱降解再酸化热酸提取冷酸提取酸提取液残留物残留物酸抽提液残留物酸提取液（RNA）（DNA）（RNA+DNA）热酸（RNA）提取残留物酸提取液（DNA）第5页，共31页，星期日，2025年，2月5日(1)热酸法把组织预处理后的沉淀部分用稀的过氯酸（PCA）或三氯乙酸（TCA）在90?C处理15min，两种核酸皆成为酸溶性物质而抽提出来，并与大部分不溶性的蛋白质分开。优点：无蛋白质干扰，迅速简单缺点：没有把DNA与RNA分开，准确度较差(2)冷酸法经酸和有机溶剂处理后用1mol/LPCA于4?C处理18h抽提出RNA，再用0.5NPCA在70?C处理20min抽提出DNA。各抽提液用定磷法，定糖法或紫外分光光度法来测定。优点：可测定微量缺点：可能部分DNA混杂于RNA中第6页，共31页，星期日，2025年，2月5日（3）碱法将酸不溶的非脂类含磷化合物与1N氢氧化钠在37?C保温过夜，RNA被碱解为酸溶性核苷酸，而DNA不被分解。加入PCA或TCA酸化后，DNA即沉淀下来，上清液中为RNA的酸解产物。优点：将DNA和RNA分开缺点：RNA部分还有其他含磷化合物第7页，共31页，星期日，2025年，2月5日二.核酸的超速离心当含有细小颗粒的悬浮液静置不动时，由于重力场的作用使得悬浮的颗粒逐渐下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液体小的粒子就会上浮。物质在介质中沉降时还伴随有扩散现象。1)扩散是无条件的绝对的。扩散与物质的质量成反比，颗粒越小扩散越严重。2)沉降是相对的，有条件的，要受到外力才能运动。沉降与物体重量成正比，颗粒越大沉降越快。颗粒越小沉降越慢，而扩散现象则越严重。3)利用离心机产生强大的离心力，才能迫使这些微粒克服扩散产生沉降运动。离心就是利用离心机转子高速度旋转产生的强大的离心力，加快液体中颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数和浮力密度的物质分离开。第8页，共31页，星期日，2025年，2月5日超速离心机第9页，共31页，星期日，2025年，2月5日密度梯度沉降平衡法1.核酸密度的测定当DNA样品的沉降速度与扩散速度达到平衡