四、应用1.检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系；2.用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。第31页，共66页，星期日，2025年，2月5日按待测核酸是否固定在固相支持物上分：固-液相杂交印迹杂交原位杂交液相杂交按照杂交分子特性分DNA-DNA杂交DNA-RNA杂交蛋白质杂交第二节核酸分子杂交的方法第32页，共66页，星期日，2025年，2月5日一、Southern印迹杂交此技术由Southern1975年首先设计。被检测对象为DNA。第33页，共66页，星期日，2025年，2月5日带有DNA片段的凝胶DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳至膜（尼龙膜或硝酸纤维素滤膜）上转膜杂交、显影凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印迹杂交的技术流程第34页，共66页，星期日，2025年，2月5日（一）待测核酸样品的制备1、裂解或破碎细胞2、抽取纯化基因组DNA3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段第35页，共66页，星期日，2025年，2月5日（二）待测DNA样品的电泳分离1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶分离小片段用高浓度胶2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子DNA泳动慢,小分子DNA泳动快，大小相同的分子处于同一条带3、分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂交所用分子量标准可用核素标记第36页，共66页，星期日，2025年，2月5日（三）凝胶中核酸的变性（碱变化）凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的单链DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液第37页，共66页，星期日，2025年，2月5日（四）Southern印迹指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程第38页，共66页，星期日，2025年，2月5日1、固相支持物的选择（1）理想的固相支持物应具备的特性①具有较强结合核酸分子的能力②不影响与探针的杂交反应③与核酸分子结合稳定牢固④具有良好的机械性能?非特异吸附少第39页，共66页，星期日，2025年，2月5日（2）常用的固相支持物①硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本底低。缺点是DNA分子结合不牢固②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高③化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能力较上述两种膜低第40页，共66页，星期日，2025年，2月5日2、Southern印迹的常用方法（1）毛细管虹吸印迹法利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。其基本原理是：容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上第41页，共66页，星期日，2025年，2月5日。第42页，共66页，星期日，2025年，2月5日（2）电转法利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。第43页，共66页，星期日，2025年，2月5日第44页，共66页，星期日，2025年，2月5日（3）真空转移法此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。第45页，共66页，星期日，2025年，2月5日第46页，共66页，星期日，2025年，2月5日（五）Southern杂交1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点