1.DNA连接酶催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键需要：3’-OH、5’-P以及NAD+或ATP做能源不能连接两条单链DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的DNA必须是双螺旋DNA分子的一部分nickgap第26页，共62页，星期日，2025年，2月5日DNA连接的分子机理第27页，共62页，星期日，2025年，2月5日连接反应的影响因素1.连接缓冲液的影响：合适酸碱度，pH的范围在7.4-7.8，较多用7.8；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反应；1-20mmol/L的DTT，较多用10mmol/L，作用是维持还原性环境，稳定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。2.ATP浓度的影响：连接缓冲液中ATP的浓度在0.5-4mmol/L之间，过浓会抑制反应。由于ATP极易分解，含有ATP的缓冲液应于-20℃保存，溶化取用后立即放回。最好小管分装贮存，防止反复冻融引起ATP分解。与限制酶缓冲液不同的是，含ATP的连接缓冲液长期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的缓冲液（可长期保存），临用时加入新配制的ATP母液。
第28页，共62页，星期日，2025年，2月5日4、连接温度与时间的影响：因为黏性末端的DNA双链间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，但连接酶的最适温度又恰为37℃。为了解决这一矛盾，在经过综合考虑后，传统上将连接温度定为16℃，时间为4-16h。对于平末端是不用考虑氢键问题的，可使用较高的温度，使酶活力得到更好的发挥。
5、载体与插入片段的量适当的载体与片段的摩尔比能提高连接效率，并减少多拷贝插入片段的的形成，一般：载体插入片段=13-10第29页，共62页，星期日，2025年，2月5日2.粘性末端DNA的连接DNA片段与载体用同一种内切酶酶切后，利用DNA连接酶将酶切形成的粘性末端连接起来单酶切时如何阻止载体的自我环化？实验中普遍采用片段和载体用不同的酶双酶切形成不同的粘性末端，这种操作具有方向性第30页，共62页，星期日，2025年，2月5日第31页，共62页，星期日，2025年，2月5日3.平末端DNA的连接直接用T4DNA连接酶（需要ATP及高浓度酶）（1）同聚物加尾法第32页，共62页，星期日，2025年，2月5日（2）衔接物连接法第33页，共62页，星期日，2025年，2月5日双衔接物连接法第34页，共62页，星期日，2025年，2月5日（3）DNA接头连接法第35页，共62页，星期日，2025年，2月5日练习题第36页，共62页，星期日，2025年，2月5日第37页，共62页，星期日，2025年，2月5日TMTC：toomanytocount第38页，共62页，星期日，2025年，2月5日答案：第39页，共62页，星期日，2025年，2月5日第三节DNA聚合酶DNA聚合酶能够把脱氧核糖核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板上解离的情况。第40页，共62页，星期日，2025年，2月5日1.DNA聚合酶I在50年代的中期，A.Kornberg发现了DNA聚合酶Ⅰ（DNApolymeraseⅠ，DNApolⅠ）原来称为Kornberg酶。以后又相续发现了DNApolⅡ和DNApolⅢ。DNA聚合酶的共同特点是：（1）需要提供合成模板；（2）不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3－OH；（3）合成的方向都是5→3；（4）除聚合DNA外还有其它功能。
冈崎片段第41页，共62页，星期日，2025年，2月5日1.DNA聚合酶I（polI）三种酶催活性：5’-3’聚合酶活性5’-3’核酸外切酶活性3’-5’核酸外切酶活性polI催化合成DNA的三种条件：（1）存在四种dNTPs和Mg2+（2）带有3’-OH游离基团的引物链（3）DNA模板（双链或单链）链合成方向：5’3’第42页，共62页，星期日，2025年，2月5日polI的5’3’聚合作用第43页，共62页，星期日，2025年，2月5日polI的5’3’核酸外切酶活性（切除修复）必须是位于双螺旋的区段上；切割部位既可以是末端也可以是距末端数个核苷酸远的磷酸二酯键；伴随发生的DNA合成可以增强5’-3’外切酶的活性；对双链DNA的单链缺口有活性但要存在5’-P基团。用枯草杆菌蛋白酶切割成两个片段，一个片段36kDa具有5’-3’外切酶的活性;另一片段76kDa具有聚合酶活性及3’-5’外切酶