关于免疫胶体金银技术第1页，共33页，星期日，2025年，2月5日免疫金技术发展简史1971年胶体金应用于免疫组化1978年免疫金技术检测B淋巴细胞表面抗原1981年免疫金银法1986年彩色免疫金银法第2页，共33页，星期日，2025年，2月5日免疫胶体金银技术一、免疫金技术二、免疫金银法三、彩色免疫金银法四、免疫金和免疫金银法的优点五、免疫金银法染色中常见的问题及对策六、免疫胶体铁技术第3页，共33页，星期日，2025年，2月5日一、免疫金技术胶体金：金的水溶液，具有一般溶胶特性。胶体金制备：化学还原法；在一定浓度的金溶液中加入一定量的还原剂使金离子变成金原子（氯金酸在还原剂作用下，聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态）。胶体金颜色：用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。5-20nm葡萄酒红20-40nm深红色60nm橙黄色还原剂：白磷、乙醇、过氧化氢、枸橼酸钠、鞣酸等胶体金标记：实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。胶体金颗粒与蛋白质因静电吸附而形成牢固结合。此外，还可与葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合。
第4页，共33页，星期日，2025年，2月5日(2)试剂容器:酸处理洗净配制试剂:双蒸馏水或三蒸馏水氯化金水溶液的配制：1g的氯化金溶解于双蒸水中配成l％的水溶液；4℃冰箱内保存。白磷配制：在双蒸水中切块，吸干水分；放入乙醚至溶解，棕色瓶密闭保存不需硅化处理可直接制备胶体金。为了减少了金颗粒的吸附作用，也可用已制备的同等大小颗粒的胶体金溶液包被玻璃器皿表面，弃去，再用双蒸水洗净。流水冲洗；清洁液浸泡24h；自来水洗净清洁液；洗洁剂洗3～4次；自来水冲洗；蒸馏水洗3～4次；双蒸水把每个器皿洗3～4次；烤箱干燥后备用。1制备胶体金的准备（1）玻璃器皿的清洁第5页，共33页，星期日，2025年，2月5日2胶体金的制备白磷还原法、抗坏血酸还原法、柠檬酸三钠还原法、柠檬酸钠—鞣酸还原法、乙醇超声波还原法、硼氢化钠还原法、放射性胶体金制备法常用的方法:2种(1)柠檬酸三钠还原法制备程序很简单，胶体金的颗粒大小较一致，广为采用。制备胶体金时金颗粒的大小与柠檬酸三钠用量成反比。操作步骤：1）1mll％氯化金加入100ml蒸馏水中，煮沸。2）迅速加入4mll％柠檬酸钠，保持沸腾状态，搅动至出现透明的橙红色。3）自来水冲洗烧瓶，冷却。第6页，共33页，星期日，2025年，2月5日(2)柠檬酸钠—鞣酸还原法特点：通过改变鞣酸的用量制备出多种颗粒直径的胶体金，且颗粒的直径均匀一致，适合于双标及多标研究。操作步骤：1）根据所需的胶体金颗粒分别配制A液和B液。2）将配制好的A、B两液在水浴内加热到60℃，保持温度稳定。3）在电磁搅拌器上搅拌A液迅速加入B液，加热7～10min至胶体金变成葡萄酒色。4)用自来水冲洗烧瓶，使之迅速冷却。原理：柠檬酸三钠——主要为还原剂。鞣酸——还原、保护作用，决定胶体金颗粒大小形成。第7页，共33页，星期日，2025年，2月5日制备胶体金时都应注意以下各点：①所有溶液均应用双蒸水配制②柠檬酸钠与鞣酸溶液应现用现配③用于制备胶体金的烧瓶硅化需处理④在清洁干燥的烧瓶中加入少许1％硅油，轻轻转动烧瓶，使硅油均匀铺展于烧瓶内壁，倾出多余硅油。烧瓶置烤箱内烘干。上述步骤可重复2～3次第8页，共33页，星期日，2025年，2月5日3蛋白质的胶体金标记
原理：PH值等于或稍偏碱性的蛋白质等电点时，蛋白质呈中性，此时蛋白质分子与胶体金颗粒相互间的静电作用较小，但蛋白质表面张力最大，处于微弱的水化状态，能牢固吸附于金颗粒表面，形成蛋白层，阻止胶体金颗粒相互接触，而使胶体金处于稳定状态；PH值高于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，与胶体金颗粒负电荷相互排斥不能结合。稳定剂：牛血清白蛋白、卵白蛋白、聚乙二醇、明胶第9页，共33页，星期日，2025年，2月5日（1）待标记蛋白质准备透析除盐除去蛋白质内多余电解质，过高的盐类物质会降低胶体金颗粒的电位，影响蛋白质吸附。方法:蛋白质置于透析袋直接放入双蒸水或极低浓度盐水透析去除蛋白沉淀低温保存的蛋白质或抗体易形成聚合物，聚合