第1页，共7页，星期日，2025年，2月5日一、实验目的及内容目的：1、复习革兰氏染色法的原理2、初步掌握细菌的涂片方法及革兰氏染色法的步骤3、了解细菌的芽孢染色的原理，掌握芽孢染色方法内容：1、制作细菌的染色装片（复习简单染色的方法）2、通过革兰氏染色，确定苏云金芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌、大肠杆菌为革兰氏阴性还是阳性细菌3、细菌的芽孢染色第2页，共7页，星期日，2025年，2月5日二、实验原理1、革兰氏染色原理：革兰氏染色法是将所有的细菌区分为革兰氏阳性（G＋）和革兰氏阴性（G－）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是肽聚糖层厚度和结构决定的。经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物；乙醇能使它溶解，所以，染色的前二步结果是一样的，但在G+细胞中，由于细胞壁厚、肽聚糖网层次多和交联致密，故遇脱色剂乙醇时，因失水而网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇的处理不会溶出缝隙，因此能把结晶紫和碘的复合物(分子太大)牢牢留在壁内，使其保持紫色。反之，在G-细菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖网层薄和交联度差，遇脱色剂乙醇后，以类脂为主的外膜迅速溶解，乙醇处理不但破坏了胞壁外膜，还可能损伤肽聚糖层和细胞质膜，这时薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫和碘的复合物的溶出，因此细胞退成无色。当再用衬托的染色液复染时，显现红色。红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，红色显示不出来。第3页，共7页，星期日，2025年，2月5日2、芽孢染色原理芽孢染色法是根据细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同的染料进行染色，使芽孢和菌体呈不同颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，当用弱碱性染料孔雀绿在加热的情况下进行染色时，此染料可以进入菌体及芽孢使其着色，而进入芽孢的染料则难以透出。若再复染（蕃红液），则菌体呈红色而芽孢呈绿色。第4页，共7页，星期日，2025年，2月5日四、操作步骤【一】革兰氏染色的步骤操作（一）制片1、涂片：在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水，用无菌操作的方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂片的面积大约1～1.5cm22、干燥：将涂片于室温中自然干燥3、固定：菌面朝上，通过火焰2—3次固定（温度以不烫手为宜）（二）染色1、初染：在制片上滴加结晶紫染液，染色1分钟2、水洗：倾去染色液，用水小心的冲洗3、媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1分钟4、脱色：将玻片倾斜，连续点滴95％乙醇通过涂面，脱色20—30秒，至流出的液体无色，立即水洗5、复染：滴加番红复染3—5分钟6、水洗：用水洗去涂片上的番红染色液7、晾干：将染好的涂片放在空气中晾干或者用吸水纸吸干（三）镜检先用低倍，再用高倍，最后用油镜进行观察第5页，共7页，星期日，2025年，2月5日