三、M13噬菌体克隆载体（一）M13DNA 丝状噬菌体，内有一环状单链DNA分子（“+”链DNA） 大小：6.4kb 结构：10个区基因间隔区（IS区） 含复制起始位点及可插入外源DNA的位点第55页，共108页，星期日，2025年，2月5日（二）M13DNA复制和M13噬菌体增殖 M13DNA“+”链进入雄性大肠杆菌→合成“-”链→产生双链M13DNA（复制型DNA或RF-DNA）→按环状双链DNA方式复制，同时以“+”链DNA为模板转录包装蛋白→RF-DNA达200拷贝时，单链DNA特异结合蛋白与“+”链结合而阻断合成“-”链→结果只能以“-”链为模板合成“+”链→“+”链DNA被包装蛋白包装成新的M13噬菌体→挤出受体细胞→宿主细胞不被溶菌。第56页，共108页，星期日，2025年，2月5日第57页，共108页，星期日，2025年，2月5日 M13DNA复制特征：以双链DNA为中间媒介 培养物→高速离心→上清中含噬菌体颗粒→“+”链DNA 沉淀菌体→破碎后，可提取RF-DNA（三）M13噬菌体克隆载体的构建策略和途径 策略：在RF-DNA的IS区插入选择标记基因，并组装合适ＭＣＳ。 RF-DNA上有10个BsuI位点→部分酶切→获得全长线形RF-DNA,与含LacZ`标记的HindⅢ酶切片段进行平末端连接→M13mp1载体。为获得合适的克隆位点,可在LacZ`区插入ＭＣＳ连杆构建成对M13载体，保证外源DNA两条链都能随“+”链一起复制包装。第58页，共108页，星期日，2025年，2月5日（四）M13克隆载体的优点与应用优点：1、以双链环形DNA为中间媒介复制，可与质粒一样体外纯化操作2、制备的M13DNA单、双链都能转化大肠杆菌，直接转染受体细胞3、单链DNA不受包装限制，可包装M13DNA分子6倍的DNA分子4、可产生大量纯化的含外源DNA插入的单链DNA分子 主要用途：克隆、分离单链外源DNA片段 获得的“+”链可直接用于DNA测序第59页，共108页，星期日，2025年，2月5日四、CaMV克隆载体 花椰菜花叶病病毒（CaMV）环状双链DNA分子（一）CaMVDNA分子 大小：8kb 结构：在病毒颗粒中呈开环形式，负链有一缺口，正链有两缺口。进入植物细胞后单链部分被酶解，缺口自行闭合，成为环状DNA分子。第60页，共108页，星期日，2025年，2月5日第61页，共108页，星期日，2025年，2月5日（二）CaMV基因区8个阅读框（ORF）和3个间隔区（IR1～3） IR1－ORFVI与ORFVII之间 IR2－ORFVII与ORFI之间 IR3－ORFV与ORFVI之间 IR1和IR3区各有一个启动子结构，分别启动同方向转录35SRNA和19SRNA，而两者的终止子都在IR1区。 35S启动子——组成型强启动子。组装了35S启动子的外源基因可在植物细胞高效表达，在蓝藻细胞内也有效表达。第62页，共108页，星期日，2025年，2月5日（三）CaMV的增殖和感染1、增殖途径： CaMV颗粒→蚜虫→病毒DNA进入植物细胞核→ 转录19SRNA→翻译 35SRNA翻译反转录“-”链DNA→复制出“+”链2、CaMV-DNA可转染植物细胞 在ORFII和ORFVII区插入外源DNA后仍能转染植物细胞包装成新的CaMV颗粒第63页，共108页，星期日，2025年，2月5日（四）构建CaMV克隆载体的基本策略和途径策略 CaMV-DNA能侵入植物细胞而将目的基因导入，并且清除CaMV对植物的致病性基因途径1、构建互补克隆载体:组装(目的基因+标记基因)而无感染能力+两种基因和感染能力都无→彼此获得对方产物→感染能力2、构建置换型克隆载体置换的外源基因较小3、构建混合型克隆载体CaMV-DNA→合适的限制性酶切→组入Ti的T-DNA区→完成构建4、构建CaMV-融合基因克隆载体系统 将35S启动子与目的基因融合，高效表达目的基因。第64页，共108页，星期日，2025年，2月5日第65页，共108页，星期日，2025年，2月5日五、烟草花叶病毒（TMV）克隆载体 单链正义RNA，6395bp特点：复制量和外壳蛋白表达量高，寄