实验二
SDS凝胶电泳
SDS凝胶电泳
实验原理
实验步骤
注意事项
SDS的优点
SDS的缺点
实验常见问题及处理
小技巧
●源起
●基本原理●分类
●分离范围
实验原理
●1969年由Weber和Osborn进一步完善。
他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂(SDS)以后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视.
源起
●1967年由Shapiro建立。
丙烯酰胺
共聚合聚丙烯酰胺
N,N’-亚甲基双丙烯酰胺
过硫酸胺(AP)
激活作用
四甲基乙二胺(TEMED
激活作用
基本原理之一
●阴离子去污剂SDS破坏蛋白质分子之间及与其它物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变其原有的构象，并同蛋白质分子充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。
●强还原剂巯基乙醇打开蛋白质分子内的二硫键使这种结合更加充分。
●结合了SDS的蛋白质在水溶液中的形状类似于长椭圆棒，不同的蛋白质-SDS复合物其椭圆棒的短轴长度恒定，而长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比。
●这样的蛋白质-SDS复合物在电场作用下，其迁移率便不再受蛋白质原有的净电荷及形状等因素的
影响，而主要取决于其分子量大小这一因素。根
据这一特点，就可以将各蛋白组分按分子量大小
分开。
基本原理之二
分类
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连
续系统和不连续系统两大类.
连续系统电泳体系中，缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
●不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH,凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
不连续系统
浓缩胶
●浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。
分离胶
●孔径较小，通过选择合适的凝胶浓度，可以
使样品很好的分离.
凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶，下层为分
离胶。在上下电泳槽内充以Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.3),
这样便形成了凝胶孔径和缓冲液pH值的不连续性。在浓
缩胶中HCI几乎全部解离为Cl-,但只有极少部分甘氨酸解离为H?NCH?CO0。蛋白质的等电点一般在pH5左右，在此条件下其解离度在HCI和甘氨酸之间。当电泳系统通电后，这3种离子同向阳极移动。其有效泳动率依次为Cl-蛋白质H?NCH?COO-,故C1-称为快离子，而
HNCHCOO-称为慢离子。
浓缩效应之一
??
浓缩效应之二
倍。
电泳开始后，快离子在前，在它后面形成离子浓度
低的区域即低电导区。电导与电压梯度成反比，所以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和慢离子之间形成一个稳定而不断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间，因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩成一条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百
电荷效应之一
样品进入分离胶后，慢离子甘氨酸全部解
离为负离子，泳动速率加快，很快超过蛋白质，高电压梯度随即消失。此时蛋白质在均一的外加电场下泳动，但由于蛋白质分子所带的有效电荷不同，使得各种蛋白质的泳动速率不同而形成一条条区带。
与SDS结合的蛋白质的构型也发生变化，在
水溶液中SDS-蛋白质复合物都具有相似的形状，使得SDS电泳的泳动率不再受蛋白质原有电荷与形状的影响。因此，各种SDS-蛋白质复合物在电泳中不同的泳动率只反映了蛋白质分子量的不同。
电荷效应之二
在SDS电泳中，由于SDS这种阴离
子表面活性剂以一定比例和蛋白质结合成复合物，使蛋白质分子带负电荷，这种负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷差别，从而降低或消除了蛋白质天然电荷的差别；此外，由多亚基组成的蛋白质和SDS结合后都解离成亚单位，这是因为SDS破坏了蛋白质氢键、疏水键等非共价键。
电荷效应之三
分离范围
●SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的聚
丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成SDS-蛋白质复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随“双丙烯酰胺