6．培养基的营养控制植物生长发育依赖外界养分的供给，如果养分供应不足，植物生长缓慢，植株矮小。因此采用降低培养基中的养分水平也可有效地抑制细胞生长，达到保存的目的。如菠萝种质在不添加任何生长调节剂的1/2MS培养基中保存12个月后存活率为92.2%，小苗的平均生长量只有1cm左右；保存苗转入分化培养基后，很快恢复生长并分化出丛生芽，在同一培养基中保存18个月后仍有85.7%的存活。第23页，共60页，星期日，2025年，2月5日7．降低培养环境中的氧气浓度通过降低培养材料周围的大气压力或氧含量来保存植物组织培养材料，这一想法最早是由Caplin（1959）提出的。近10年这方面的研究比较少。而权银等（1989）在柑橘种质离体保存中对不同封口材料的比较研究表明，封口材料以其透气性能影响试管内气体成分，从而影响保存效果。第24页，共60页，星期日，2025年，2月5日第二节超低温保存一、超低温保存概述通常将-80℃以下的温度称为超低温。超低温冷冻保存一般以液氮为冷源，使温度维持在-196℃。超低温通常指低于-80℃的低温，保存介质或容器有干冰(-79℃)、超低温冰箱(-80~-150℃)、液氮(-196℃)和液氮蒸气相(-140℃)等，其中液氮最常用。生物材料在如此低温下，活细胞内的新陈代谢和生长活动几乎完全停止，处于生理停顿状态，因而可使植物材料在该温度下不会发生遗传性状的改变，但细胞活力和形态发生的潜能可保存。第25页，共60页，星期日，2025年，2月5日第26页，共60页，星期日，2025年，2月5日超低温保存技术可极大地延长储存材料的寿命；避免细胞和组织的染色体数目因长期继代而发生的变异；避免了离体材料在长期无性繁殖过程中可能造成的退化和病虫侵害；可有效、安全地长期保存那些珍贵稀有的种质。第27页，共60页，星期日，2025年，2月5日第28页，共60页，星期日，2025年，2月5日二、超低温保存的研究概况1.超低温保存技术的发展低温干燥；减压；超低温自从1973年Nag等首次成功地超低温保存了胡萝卜悬浮细胞以来，国内外已对近200种植物材料进行了超低温保存。2.用于离体超低温保存的植物材料种子、胚、胚轴和体细胞胚保存常用干冻法茎尖和分生组织大多用玻璃化法或包埋脱水法第29页，共60页，星期日，2025年，2月5日3.超低温保存的植物种类超低温保存已涉及到不同的植物种类，如野生及人工创造的谷类、豆类、薯类、油类、糖类、纤维类、蔬菜类、果树、树木、药用植物和藻类等。第30页，共60页，星期日，2025年，2月5日超低温冷冻保存为什么没有把细胞冻死？细胞冰冻结冰保护性脱水理论溶液的玻璃化理论三、植物超低温冻存的细胞学基础第31页，共60页，星期日，2025年，2月5日细胞冰冻结冰保护性脱水理论常温下，细胞及其溶液处于渗透平衡的状态，当温度降到冰点以下时，首先是细胞外溶液部分“冻结”出冰；胞外溶液的浓度升高，破坏了细胞内外溶液的平衡，水分由胞内通过细胞膜向外渗透，细胞收缩，细胞内浓度提高；当温度不断降低时，冻结和渗透过程不断进行，这种过程称为保护性脱水。当复温时，温度升高，冻结的冰不断融化，水分由胞外向胞内渗透，使收缩的细胞膨胀，可能恢复原状。精确控制上述过程，能使细胞在降温、复温、渗透过程中不被损伤而死亡。第32页，共60页，星期日，2025年，2月5日溶液的玻璃化理论溶液在降温时，如果没有均一晶核或晶核生长缺乏足够的时间，就首先形成过冷溶液。继续降温，均一晶核形成。如果降温速度不够快，就形成尖锐的冰晶。降温速度足够快，均一晶核很少或几乎没有形成，或均一晶核生长缺乏足够的时间，溶液就进入无定型的玻璃化状态。它是一种透明的固态，与液态相比，分子没有发生重排，因此与晶态不同。被称为玻璃态，此时的温度叫玻璃化形成温度。在玻璃化形成过程中，既没有溶液效应对细胞的损伤，也没有冰晶的形成对细胞造成的机械伤害。第33页，共60页，星期日，2025年，2月5日提高超低温冷冻保存的措施由于植物细胞含水量比动物细胞高，冰冻保存难度大，如果直接将保存材料放入液氮中，组织和细胞由于细胞内水分结冰，引起组织和细胞死亡，因而，超低温保存的植物材料必须借助于冷冻防护剂(cryoprotectant)。第34页，共60页，星期日，2025年，2月5日冷冻防护剂防护机理：在水溶液中能强烈地结合水分子，水合作用的结果使溶液的黏稠度增加。当温度下降时，溶液冰点下降，即冰的结晶中心增长速度下降，使水的固化程度减弱。因而对于降低培养基冰点和植物组织、细胞冰点起重要作用。冷冻防护剂的使用提高了培养基渗透压，导致细胞的轻微质壁分离，相对提