接种量大，可缩短生长延迟期，菌体迅速繁衍，很快进入对数生长期，适于表达外源基因。接种量过高，使菌体生长过快，代谢物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。第30页，共45页，星期日，2025年，2月5日⒊温度的影响温度对基因表达的调控作用发生在复制、转录、翻译和小分子调节分子的合成等水平上。温度对发酵过程的影响是多方面的。它影响各种酶的反应速度，改变菌体代谢产物的反应方向，影响代谢调控机制。P-38第31页，共45页，星期日，2025年，2月5日适宜的发酵温度是既适合菌体的生长，又适合代谢产物合成的温度。高温或低温都会使发酵异常，影响终产物的形成并导致减产。温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。如：重组人生长激素，300C产物可溶，370C形成包含体第32页，共45页，星期日，2025年，2月5日第1页，共45页，星期日，2025年，2月5日菌体的生长通常用比生长速率来表示。工程菌培养可通过选用不同的碳源控制补料和稀释速率等方法来控制菌体的生长。控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物积累、提高外源蛋白产率有重要意义。第2页，共45页，星期日，2025年，2月5日大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是基本恒定的，因而菌体的生长速度反映了蛋白质的合成速度。培养条件的改变，都会改变菌体的能量代谢和小分子前体的供应，影响生物大分子的合成和菌体的生长。第3页，共45页，星期日，2025年，2月5日一、菌体的生长与能量的关系碳源物质是组成培养基的主要成分。碳源物质为细胞提供能量，当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产生乙酸，导致培养基的pH值下降，从而影响菌体的生长。提高pH，可减少乙酸的抑制作用第4页，共45页，星期日，2025年，2月5日分批培养中选择不同的碳源，连续培养中控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用。加入甲硫氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。第5页，共45页，星期日，2025年，2月5日大肠杆菌中克隆携带氧能力的VHB蛋白的基因可提高菌体生长速率。采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿主细胞，阻止乙酸产生，可提高产量。第6页，共45页，星期日，2025年，2月5日二、菌体生长与前体供应的关系在基础培养基中加入氨基酸（小分子前体）能使菌体比生长率提高，蛋白合成增加。基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，致工程菌生长速率降低。第7页，共45页，星期日，2025年，2月5日质粒存在对菌体代谢的影响：中等拷贝质粒（56拷贝）的工程菌中与前体合成有关的酶增加，这些酶的基因大多受终产物的反馈调节。如：三羧酸循环关键酶、天冬氨酸转酰基酶等。高拷贝质粒的工程菌（240拷贝）中，生长速率和菌体总蛋白合成均减少。这与工程菌大量前体被利用引起前体不足，从而产生“严紧反应”有关。第8页，共45页，星期日，2025年，2月5日“严紧反应”是当氨酰tRNA不足时,核糖体在密码子上停留,并合成被称为魔点的ppGpp的结果。ppGpp是一个重要的调控分子。它通过影响RNA链的延伸过程减少转录。第9页，共45页，星期日，2025年，2月5日它的浓度增加会导致在合成mRNA和rRNA时RNA聚合酶在模板上的移动产生停顿，RNA链延长速度减慢，使游离的RNA聚合酶浓度降低，严紧控制的启动子如rrnA等的转录减少。也可能ppGpp是通过干扰RNA聚合酶与PL启动子专一识别反应。影响核糖体浓度（降低）第10页，共45页，星期日，2025年，2月5日第六节基因工程菌的不稳定性基因工程菌在传代（25代以上）过程中常出现质粒不稳定的现象。分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变第11页，共45页，星期日，2025年，2月5日一、质粒不稳定产生的原因常见分裂不稳定的两个因素：⑴含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率（质粒丢失率）；⑵这两种菌（含质粒菌和不含质粒菌）比生长速率差异的大小。第12页，共45页，星期日，2025年，2月5日质粒稳定性的分析方法样品不含抗性标记抗生素平板培养基10-12h100个菌落含抗性标记抗生素平板培养基10-12h统计生长菌落数重复三次,计算比值(稳定性stability)第13页，共45页，星期日，2025年，2月5日二、提高质粒稳定性的方法1.合适的宿主：宿主菌2.合适的载体:质粒拷贝数3.选择压力：抗生素