蛋白质组学定量方法与实验流程
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02
标记定量技术
03
非标记定量策略
04
实验流程设计
05
数据分析关键环节
06
应用与标准化实践
01
定量方法概述
01
定量方法概述
PART
标记与非标记技术分类
标记技术
通过化学或生物标记对样品进行标记，如SILAC、iTRAQ、TMT等，便于样品间的比较和定量。
01
非标记技术
直接对蛋白质进行质谱分析，不需要进行标记，如Label-free、SWATH等，适用于大规模蛋白质组学研究。
02
相对定量与绝对定量差异
01
相对定量
通过比较不同样品中同一蛋白质的丰度，得出蛋白质在不同样品间的相对含量，如基于质谱信号的强度比较等。
02
绝对定量
通过已知量的标准品或加入已知量的同位素标记的标准肽段，推算出样品中蛋白质的绝对含量。
根据研究目的、样品类型、实验条件、数据量需求等因素选择合适的方法。
方法选择依据
方法选择依据与适用场景
标记技术适用于样品间差异较大的情况，如疾病与正常组织比较；非标记技术适用于大规模蛋白质组学研究，如蛋白质组数据库建立等。
适用场景
02
标记定量技术
PART
TMT/iTRAQ标记原理
TMT（ThousandMetricTonne）标记
是一种多肽体外标记技术，利用同位素标签标记多肽的氨基基团，通过串联质谱技术实现多肽的定量比较。
iTRAQ（isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation）标记
iTRAQ试剂是一种可与肽段N端及赖氨酸侧链氨基反应的标记试剂，实现不同样本中同一肽段的标记和相对定量。
同位素标记实验步骤
同位素标记实验步骤
样品制备
混合与分离
标记反应
质谱检测
将样品蛋白质提取、酶解成肽段，并进行除盐等处理。
将TMT或iTRAQ标记试剂与肽段进行反应，使肽段带上同位素标签。
将标记后的肽段混合，通过液相色谱等分离技术进行分离。
利用质谱仪对肽段进行质谱分析，获得肽段的质荷比和丰度信息。
标记效率验证标准
标记效率
通过比较标记肽段与未标记肽段的信号强度，评估标记反应的效率。一般要求标记效率达到95%以上。
重复性
准确性
对于同一批次的样品，进行多次标记和检测，评估结果的重复性。通常要求误差范围在10%以内。
通过比较已知量的标准品或内标品的检测结果，评估方法的准确性。要求误差范围在5%以内。
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03
非标记定量策略
PART
将蛋白质样品经过酶解或化学处理，得到肽段混合物。
通过高分辨率质谱仪对肽段混合物进行质谱分析，得到肽段的质量数和电荷数。
利用生物信息学方法对质谱数据进行处理，包括去噪、峰检测、峰对齐、肽段鉴定等。
根据肽段的信号强度或峰面积进行蛋白质定量，比较不同样品之间的蛋白质差异。
Label-free技术流程
样本处理
质谱分析
数据处理
定量分析
DIA/DDA数据采集模式
01
DIA（数据独立采集）模式
在质谱分析过程中，对每个肽段进行碎裂，并采集所有碎片离子的信息，从而提高蛋白质鉴定的准确性和覆盖率。
02
DDA（数据依赖采集）模式
在质谱分析过程中，根据预设的条件选择特定的肽段进行碎裂，并采集碎片离子的信息，适用于对已知肽段进行定量和验证。
数据归一化处理方法
峰面积归一化
将不同样本的肽段信号强度进行归一化处理，以消除实验过程中的误差和变异。
蛋白质归一化
信号强度归一化
将每个肽段的峰面积归一化到总峰面积中，以消除样本之间的肽段总量差异。
将每个肽段定量结果归一化到其所属的蛋白质中，以消除肽段数量不同带来的影响。
04
实验流程设计
PART
样品制备与预处理
样品制备与预处理
蛋白质提取
肽段纯化
蛋白质酶解
肽段定量
选择适当的方法，如细胞裂解、组织研磨等，将蛋白质从样品中释放出来。
使用胰蛋白酶或其他酶将蛋白质酶解成肽段，提高检测效率和准确性。
通过固相萃取、离子交换等方法去除样品中的杂质和干扰物，提高质谱检测的灵敏度。
采用同位素标记、化学标记等方法对肽段进行绝对或相对定量。
色谱柱类型选择
根据样品特性和分析需求选择不同类型的色谱柱，如反相色谱柱、离子交换色谱柱等。
流动相组成优化
调整流动相中有机溶剂、离子强度和pH值等参数，以获得最佳的肽段分离效果。
梯度洗脱程序设置
制定合适的梯度洗脱程序，使肽段按照极性、大小等特性进行分离。
色谱柱温度控制
控制色谱柱的温度，以减少色谱柱内的扩散效应和固定相的降解。
色谱分离参数优化
根据实验需求选择合适的质谱仪器，如离子阱质谱、四极杆质谱、飞行时间质谱等。
调整离子源的电压、温度等参数，以获得最佳的离子化效率和离子稳定性。
选择合适的扫描模式，如全扫描、选择离子扫描等，以获得丰富的质谱数据。
采用专业的软件对质谱数据