***********************细胞凋亡第63页，共78页，星期日，2025年，2月5日二、细胞凋亡的检测方法1、形态观察法：凋亡的细胞皱缩，质膜完整，胞浆致密，细胞器密集，不同程度退变；核染色质致密，形成形状不一，大小不等的团块边集于核膜处，进而胞核裂解；胞浆发生芽突。胞浆芽突脱落后，形成许多凋亡小体。2、生化检测法：①胞浆内Ca2+浓度升高。
②细胞内活性氧增多。
③质膜通透性增高。
④DNA内切酶被激活，双链DNA在核小体之间切断形成180~200bp的特征性的有序片段。
⑤Ⅱ型谷氨酰胺转移酶和钙蛋白酶（Calpain）活性升高。3、流式细胞仪检测法第64页，共78页，星期日，2025年，2月5日1、形态观察法（1）普通光镜检测HE染色甲基绿-派诺宁染色：细胞凋亡是一种细胞主动死亡过程，需要有细胞内蛋白酶的激活，细胞质内常有mRNA表达的增强。而细胞坏死是一种被动的细胞死亡过程，细胞质内常有RNA的损失。根据这一特点，可应用试剂甲基绿对DNA染色的特异性和派诺宁对RNA的亲和性，使甲基绿对固缩细胞核内的脱氧核糖核酸着染，如果细胞质内核糖核酸呈派诺宁阳性染色者为凋亡细胞，呈阴性染色者为坏死细胞。二、细胞凋亡的检测方法第65页，共78页，星期日，2025年，2月5日甲基绿-派诺宁染色：光学显微镜下凋亡细胞和坏死细胞均表现为细胞固缩：其中凋亡细胞细胞核呈绿色或绿蓝色着染，胞质呈红紫色着染，坏死细胞只有固缩细胞，核绿色着染，而细胞质无染色。第66页，共78页，星期日，2025年，2月5日（2）荧光显微镜检测—溴化丙锭（PI）染色：碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。第67页，共78页，星期日，2025年，2月5日（3）透射电子显微镜：已经用于凋亡细胞的检测。镜下可见凋亡细胞体积变小、细胞质浓缩、细胞核变小、染色质浓缩并凝结成块，出现染色质沿核膜内侧排列的核边集现象。晚期的凋亡细胞，清晰可见细胞核裂解产生的凋亡小体。第68页，共78页，星期日，2025年，2月5日2、生化检测法（1）凝胶电泳法：（2）原位末端标记法（3）二苯胺分光光度法二、细胞凋亡的检测方法第69页，共78页，星期日，2025年，2月5日（1）凝胶电泳法原理：凋亡细胞的突出特征是由于内源性核酸内切酶的激活而导致细胞核DNA的断裂。典型的细胞凋亡，在核内形成大量200bp大小及其倍体的核苷酸片段，而非典型的凋亡细胞，由于核内的DNA降解不完全，仅形成300~50kb的DNA大片。利用这一特性，可通过DNA凝胶电泳来判定凋亡的发生和发展情况。方法：提取总DNADNA凝胶电泳观察DNAladder现象第70页，共78页，星期日，2025年，2月5日凝胶电泳特点
(1)本方法不能检测单个细胞水平的凋亡。
(2)不能提供细胞发生凋亡所处的组织位置和细胞分化状态。第71页，共78页，星期日，2025年，2月5日（2）原位末端标记法（TUNEL）原理：利用标记的dUTP，在TdT作用下结合DNA断片的3’末端羟基，显示断链DNA，提示凋亡方法：制备组织切片标记物结合标记物显色镜检第72页，共78页，星期日，2025年，2月5日TUNEL染色：细胞核固缩有的呈碎片状，不规则，大小不一致，呈棕黄色颗粒者为阳性细胞。即凋亡的细胞第73页，共78页，星期日，2025年，2月5日（3）二苯胺分光光度法原理：细胞凋亡可产生低分子量DNA，通过超速离心可与细胞核的高分子量DNA分离，分别测定两种DNA，即可得出凋亡百分率。方法：裂解细胞13000g超速离心分别提取DNA使DNA显色，测定第74页，共78页，星期日，2025年，2月5日凋亡百分率=上清液OD值上清液OD值+沉淀OD值第75页，共78页，星期日，2025年，2月5日3、流式细胞仪法原理：PI标记凋亡细胞，通过FACS可显示凋亡细胞的特征性亚二倍体峰。并可经计算分析得出凋亡百分率。方法：制备细胞悬液PI染色FACS检测二、细胞凋亡的检测方法第76页，共78页，星期日，2025年，2月5日第77页，共78页，星期日，202