关于实验重组质粒提取及双酶切鉴定第1页，共36页，星期日，2025年，2月5日实验目的掌握质粒提纯的原理和方法;掌握核酸内切酶切割质粒的原理并学会运用内切酶.第2页，共36页，星期日，2025年，2月5日预习：基因克隆示意图第3页，共36页，星期日，2025年，2月5日基因克隆操作过程：分分离载体和目的基因切限制酶切载体与目的基因接拼接重组体转转入受体菌筛筛选重组体第4页，共36页，星期日，2025年，2月5日基因载体（genevector）＊什么是基因载体 把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行复制和表达的工具＊基因载体的作用 ※为目的基因提供进入受体细胞的转移能力 ※为目的基因提供在受体细胞中的复制（或整 合）和表达 所需条件第5页，共36页，星期日，2025年，2月5日基因载体应具备特点1.具有独立复制能力，在细胞中能大量繁殖，从而使目的基因大量扩增2.作为表达载体应能利用宿主的酶系统，表达目的基因（表达能力）3.具有适当的限制性内切酶识别和切割位点（酶切位点）4.细胞内稳定性高（持续表达和复制）5.具有供筛选用的（遗传标记）6.相对分子量小（一定的容量）*第6页，共36页，星期日，2025年，2月5日基因载体类型质粒(plasmid)粘粒（cosmid）噬菌体(phage)病毒(virus)DNA染色体（BAC/YAC）*第7页，共36页，星期日，2025年，2月5日一.质粒DNA的制备1关于质粒的概念a.什么是质粒（plasmid）？b.质粒的本质是什么？c.质粒有哪些构型？c.质粒有哪些特点？d.质粒的用途有哪些？*第8页，共36页，星期日，2025年，2月5日(1)质粒的定义质粒是存在于细菌体内、独立于染色体的、可以自主复制的一类双链环状DNA，在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋(supercoil)形式存在。*第9页，共36页，星期日，2025年，2月5日①超螺旋DNA(SCDNA)(2)质粒的三种构型*第10页，共36页，星期日，2025年，2月5日②开环DNA(opencircularDNA,OCDNA)如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。
*第11页，共36页，星期日，2025年，2月5日③线状DNA(linearDNA,LDNA):如果两条链均断开，即为线状DNA。电泳时，三者泳动速度大小关系（？？？）*第12页，共36页，星期日，2025年，2月5日(3)质粒DNA的一般特性：①质粒是细菌内的共生型遗传因子,有相对独立性。②它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型。③它是双链闭合环状DNA，分子量大小不等。*(4)提取质粒DNA的目的与意义（？）基因载体/基因克隆/基因工程第13页，共36页，星期日，2025年，2月5日2提取质粒DNA的常规方法:2.1核酸分离纯化的总原则：?保证核酸一级结构完整?排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、糖、有机溶剂、金属离子、其他DNA、RNA等）第14页，共36页，星期日，2025年，2月5日3.2分离纯化质粒DNA的主要步骤①培养细菌使质粒扩增（DNA的扩增与选择）②细菌的收集与裂解收集——高速离心的方法③质粒DNA的纯化所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环状的性质。第15页，共36页，星期日，2025年，2月5日3.SDS-碱裂解法提取质粒DNA3.1实验原理：①在有EDTA及去污剂（SDS）存在的条件下，用碱处理细菌，可以使细菌的细胞壁破裂，释放出细胞内容物（染色体DNA、质粒DNA、蛋白质和RNA等）；处理过程中，染色体DNA断裂成不同长度的双链DNA。*第16页，共36页，星期日，2025年，2月5日②强碱环境（pH12.0-12.6）时：宿主菌的线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性，而质粒DNA共价闭合环状的双链并不完全分离；③当加入高浓度酸性盐，pH值恢复至中性时：变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物；而质粒DNA又恢复天然构型，能溶解在上清液中，这样通过离心可以把染色体DNA、蛋白质-SDS复合物等一起除去。*第17页，共36页，星期日，2025年，2月5日④如果要提高DNA的纯度，则可以用RNA酶消化