细胞培养无菌操作技术规范
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CONTENTS
01
无菌环境构建
02
设备与耗材准备
03
人员操作准则
04
细胞处理规范
05
污染监测体系
06
应急处理方案
01
无菌环境构建
实验室分区与气流控制
将实验室划分为洁净区、半洁净区和污染区，确保各区域互不交叉。
实验室功能分区
洁净区采用层流罩或层流床，确保气流从洁净区流向污染区，避免污染。
气流方向与洁净度
定期检查和维护通风系统，确保空气洁净度和气流方向。
通风系统维护
超净工作台操作标准
物品摆放
工作台内只放置必要的实验器材和试剂，且需有序摆放，避免杂乱无章。
03
工作台内操作必须遵循无菌技术，如穿戴无菌手套、口罩和帽子，避免交叉污染。
02
操作规范
工作台消毒
每次使用前，用70%乙醇或紫外线灯对工作台进行彻底消毒。
01
紫外线灭菌程序管理
紫外线灯管选择
选用适合实验需求的紫外线灯管，如低压汞灯或LED灯。
01
紫外线照射时间
根据物品材质和紫外线强度，确定合适的照射时间，确保灭菌效果。
02
紫外线灯管维护
定期擦拭紫外线灯管，确保其表面干净无灰尘，同时检查其工作状态是否正常。
03
02
设备与耗材准备
培养箱及离心机消毒规范
每次使用前，用紫外线灯照射培养箱和离心机内部，时间不少于30分钟，以达到表面消毒效果。
紫外线消毒
酒精擦拭
高效过滤器
用70%的酒精擦拭培养箱和离心机的内壁、转盘和橡胶密封条等易污染部位。
定期检查和更换高效过滤器，确保其过滤效果。
使用前，用70%的酒精擦拭移液器的外表面，特别是操作部位。
常规消毒
每次操作必须使用无菌的专用枪头，避免交叉污染。
专用枪头
操作时，将移液器置于超净台内，避免手部或其他污染物接触移液器。
无菌操作
无菌移液器使用要点
培养基预过滤流程
过滤操作
将培养基倒入过滤装置中，通过过滤器过滤，注意控制过滤速度，避免过滤器破裂。
03
将过滤器安装在过滤装置上，并检查过滤器的完整性和密封性。
02
过滤前准备
选用合适的过滤器
选用0.22μm的过滤器，以过滤掉培养基中的细菌、真菌等微生物。
01
03
人员操作准则
手部是细菌的主要来源，戴手套能有效减少手部细菌。
戴手套
无菌服应遮盖全身，避免身体其他部位的细菌污染操作环境。
穿无菌服
01
02
03
04
遮盖口鼻，减少呼吸时带入的细菌。
戴口罩
头套和脚套能防止头发和脚部细菌污染操作环境。
戴头套和脚套
无菌服穿戴步骤
涂消毒液：取适量消毒液，均匀涂抹于双手表面。
湿润手部：用流动水将双手彻底湿润。
搓揉双手：按照七步法搓揉双手，包括指缝、指尖、手掌、手背等各个部位。
冲洗双手：用流动水将消毒液冲洗干净。
消毒指尖：用无菌棉签蘸取消毒液，对指尖进行消毒。
擦干双手：用无菌毛巾或空气干燥器将双手擦干。
保持手部干燥：在操作前确保双手彻底干燥，避免细菌滋生。
手部消毒七步法
生物安全柜内操作姿态
保持稳定
避免交叉污染
器材摆放有序
废弃物处理
在生物安全柜内操作时，应保持身体稳定，避免晃动。
操作时注意避免不同样品之间的交叉污染。
将所需器材整齐摆放在安全柜内，避免操作时手忙脚乱。
将废弃物放入指定的容器中，避免污染环境和样品。
04
细胞处理规范
冻存管解冻防污染措施
冻存管的选择
采用无菌、密封、可记录的冻存管。
01
解冻操作
将冻存管置于37℃水浴中，轻轻摇动使其快速解冻，避免细胞受损。
02
解冻后处理
解冻后的细胞需尽快进行培养或离心处理，避免在室温下长时间放置。
03
培养基更换操作时序
根据细胞生长速度和培养基的营养成分，定期更换培养基，保证细胞正常生长。
更换频率
采用无菌技术，轻轻倾斜培养瓶，使旧培养基流出，然后加入新的培养基。
更换方法
更换完培养基后，需检查培养瓶是否密封良好，避免污染和液体泄漏。
更换后的处理
传代培养交叉污染预防
传代后观察
传代后需定期观察细胞的生长状态和形态，及时发现并处理污染问题。
03
采用无菌技术，避免细胞之间的交叉污染，如使用无菌吸管、培养瓶等。
02
传代操作
传代前处理
传代前需对培养瓶、试剂、操作台等进行严格的消毒和无菌处理。
01
05
污染监测体系
空气沉降菌检测频率
在进行细胞培养前和细胞培养过程中，应定期检测空气沉降菌的数量。
检测时机
检测频率
检测方法
细胞培养室应每周至少进行一次空气沉降菌检测，确保空气质量符合细胞培养要求。
可使用沉降法或撞击法检测空气中的微生物数量，确保数据的准确性。
支原体污染筛查方法
筛查时机
在细胞培养过程中，需定期进行支原体污染筛查，以避免支原体对细胞生长和实验结果的影响。
01
筛查方法
可使用PCR技术、培养法等方法进行支原体污染筛查，确保细胞培养体系的纯净性。
02
筛查频率
至少每月进行一次支原体污染筛查