细胞传代培养步骤
演讲人：
2025-06-03
目录
CONTENTS
01
实验前准备
02
细胞状态评估
03
细胞消化处理
04
细胞重悬与接种
05
后续培养管理
06
注意事项与质量控制
01
实验前准备
无菌操作台预清洁
用70%乙醇或适当的表面消毒剂彻底擦拭无菌操作台表面，并确保消毒剂完全蒸发。
擦拭台面
将接种环等金属器具在火焰上灼烧，并冷却至适当温度。
消毒接种环
将所需的无菌试管、培养皿、吸头等放置于操作台内，并确保处于无菌状态。
准备无菌物品
培养基与试剂配制
基础培养基
pH值调整
添加生长因子与抗生素
过滤除菌
选择合适的培养基，按照说明书准确称量各种成分，并溶解于适量的蒸馏水中。
根据细胞类型和培养要求，向培养基中加入适量的生长因子、抗生素等添加剂。
使用无菌的酸或碱溶液调整培养基的pH值至适宜范围，并用pH计进行精确测量。
将配制好的培养基通过滤器进行过滤，以去除其中的杂质和细菌。
离心机与培养箱预热
离心机预热
将离心机预热至适当的温度，通常与细胞培养温度相同。
01
培养箱预热
将培养箱预热至适宜的温度和湿度条件，以确保细胞在最佳环境下生长。
02
检查培养箱内的环境
确认培养箱内的气体浓度、湿度和洁净度等条件符合细胞培养的要求。
03
02
细胞状态评估
显微镜下观察细胞密度
可能导致细胞增殖缓慢、遗传变异或细胞老化等问题。
细胞密度过低
细胞密度过高
合适的细胞密度
可能导致细胞生长空间受限、营养不足或代谢废物积累等不利因素。
根据细胞类型和实验需求，选择合适的细胞密度进行培养。
检测细胞形态完整性
可能表示细胞处于应激状态或受到损伤，需进行进一步处理。
形态异常
细胞呈圆形或椭圆形，边缘光滑，无明显突起或凹陷。
形态正常
通过显微镜观察，结合细胞形态学特征，判断细胞形态是否完整。
判定标准
培养基浑浊度判断
培养基严重浑浊
表示细胞已经死亡或裂解，需立即处理或更换新鲜培养基。
03
表示细胞生长旺盛，代谢活跃，是细胞培养的正常状态。
02
培养基轻微浑浊
培养基澄清
表示细胞生长缓慢或营养消耗较少，需进一步观察。
01
03
细胞消化处理
消化液种类
根据细胞类型选择适宜的消化液，如胰蛋白酶、胶原酶等。
用量控制
消化液选择与用量控制
根据细胞数量和消化液浓度确定消化液用量，避免过度消化或消化不足。
01
02
消化时间与温度监控
01
消化时间
根据细胞类型和消化液浓度确定消化时间，避免过度消化导致细胞损伤。
02
温度控制
消化温度一般控制在37℃左右，适宜的温度有助于消化酶的活性。
终止消化的时机判定
当细胞形态变圆、透亮，且不再成片连接时，即可终止消化。
观察细胞形态
用吸管轻轻吹打消化后的细胞悬液，使细胞分散成单个状态。
轻轻吹打
04
细胞重悬与接种
离心速度与时间参数
采用相对离心力（RCF）表示，不同细胞系离心速度有所不同，通常在100-1000×g范围内选择。
离心速度
根据细胞类型和培养条件而定，一般离心时间为3-5分钟，确保细胞充分沉淀。
离心时间
01
02
细胞计数与接种比例
使用血细胞计数板或细胞计数器进行细胞计数，确保每毫升细胞悬液中的细胞数量准确。
细胞计数
根据实验需求，选择合适的接种比例，如1:2、1:3、1:5等，以保证细胞在培养过程中的生长和繁殖。
接种比例
标记内容
包括细胞名称、代数、接种日期、培养基种类等关键信息，以便追踪和管理。
标记位置
在培养瓶的侧面或底面进行标记，确保字迹清晰、不易脱落。
新培养瓶标记规范
05
后续培养管理
培养箱环境参数设置
温度控制
细胞生长需要恒定的温度，一般维持在37℃左右，根据细胞类型可以进行微调。
湿度控制
气体浓度
培养箱内湿度要保持在适宜范围内，一般保持在95%左右，过湿或过干都会影响细胞生长。
细胞需要氧气和二氧化碳等气体进行代谢，培养箱内要保持适宜的氧气和二氧化碳浓度，一般氧气浓度为95%，二氧化碳浓度为5%。
1
2
3
细胞贴壁状态跟踪
定期使用显微镜观察细胞贴壁状态，确保细胞生长良好，形态正常。
显微镜观察
细胞形态是判断细胞生长状态的重要指标，要定期评估细胞的形态、大小、透明度等。
细胞形态评估
细胞贴壁率是反映细胞生长状态的重要参数，要定期统计细胞贴壁率，确保细胞生长稳定。
贴壁率监测
污染风险监测方法
细胞污染检测
定期对细胞进行污染检测，如细菌、真菌、支原体等，确保细胞培养环境的纯净。
03
每次更换培养基前，要检查培养基是否有污染迹象，如浑浊、沉淀等。
02
培养基检查
无菌操作
细胞培养过程中要严格遵守无菌操作规程，避免污染。
01
06
注意事项与质量控制
无菌操作关键控制点
实验前准备
实验前需对操作台、移液器、试管、培养皿等进行彻底的消毒和灭菌处理。
02
04
03
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