杂交瘤细胞制备技术流程
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目录
CONTENTS
01
技术原理概述
02
实验前准备
03
细胞融合流程
04
关键技术要点
05
质量控制与检测
06
应用与展望
01
技术原理概述
杂交瘤技术基本概念
细胞融合
杂交瘤技术的基础，是将两个或多个不同种类的细胞合并成一个细胞的过程。
01
杂交瘤细胞
通过细胞融合产生的具有双亲细胞特性的新细胞，能同时表达两种亲代细胞的遗传信息。
02
杂交瘤技术
一种重要的生物技术，利用细胞融合的原理制备杂交瘤细胞，进而生产单克隆抗体等生物制品。
03
单克隆抗体制备意义
单克隆抗体只针对一种特定的抗原表位，具有高度的特异性和亲和力。
高度特异性
通过杂交瘤技术，可以在体外无限繁殖并生产单克隆抗体，满足科研和临床需求。
制备量大
单克隆抗体易于纯化和分离，可去除其他杂质的干扰，提高检测的准确性。
纯化方便
细胞融合理论基础
细胞膜的融合
杂交瘤细胞的筛选
细胞核的融合
细胞融合的关键步骤，需要特定的融合条件，如融合剂、温度、pH等。
细胞膜融合后，两个细胞的细胞核相互融合，形成杂种细胞核，表达双亲细胞的遗传信息。
通过特定的选择培养基和筛选方法，将杂交瘤细胞从融合后的细胞中筛选出来，进行进一步的培养和扩增。
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实验前准备
实验材料与设备清单
杂交瘤细胞株F：科技资源，需从服务机构获取，服务机构为中国典型培养物保藏中心细胞库。
培养基：RPMI1640、DMEM等完全培养基，用于细胞培养。
胎牛血清：提供细胞生长所需的生长因子和营养物质。
酶：如胰蛋白酶、胶原酶等，用于细胞分离和传代。
抗体：特异性抗体，用于细胞筛选和鉴定。
无菌器材：培养皿、离心管、吸管、细胞计数板等。
免疫动物选择与处理
动物种类
免疫方法
动物饲养
免疫效果评估
选择BALB/c小鼠等适宜的免疫动物。
采用注射抗原、佐剂等方法刺激动物免疫系统，使其产生特异性抗体。
保持动物健康状态，提供充足的饲料和水，定期更换垫料。
通过ELISA等方法检测动物血清中的特异性抗体水平。
采用RPMI1640等完全培养基，加入适量的胎牛血清。
培养基
37℃、5%CO2的培养箱中培养，保持细胞生长状态良好。
培养条件
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03
04
选择适宜的骨髓瘤细胞株，如SP2/0细胞。
骨髓瘤细胞种类
定期传代培养，同时冻存部分细胞以备后用。
传代与冻存
骨髓瘤细胞培养条件
03
细胞融合流程
免疫脾细胞分离步骤
选择已经免疫且抗体水平较高的动物作为免疫脾细胞来源。
免疫动物选择
将免疫动物的脾脏取出，经过机械研磨和过滤，得到单细胞悬液。
脾细胞制备
对制备的脾细胞进行计数，并评估细胞的活力。
细胞计数与活力评估
PEG介导的细胞融合
融合后处理
将融合后的细胞悬液缓慢加入适量的培养液中，以稀释PEG并终止融合过程。
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将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞按一定比例混合，加入PEG并轻轻振荡，使细胞融合。
02
融合过程
细胞融合剂选择
常用的细胞融合剂为聚乙二醇（PEG），具有高效、低毒的特点。
01
HAT选择性培养基应用
原理
HAT选择性培养基能够杀死未融合的骨髓瘤细胞和免疫脾细胞，只留下杂交瘤细胞。
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培养基配制
在培养基中加入HAT成分，如次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷。
02
杂交瘤细胞筛选
将融合后的细胞悬液接种于HAT选择性培养基中，培养一段时间后，只有杂交瘤细胞能够存活并增殖。
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04
关键技术要点
融合效率优化方法
使用聚乙二醇作为融合剂，促进细胞融合，提高融合效率。
聚乙二醇（PEG）法
电融合法
病毒感染法
利用电场作用使细胞膜发生瞬间穿孔，促进细胞融合，提高融合效率。
利用病毒作为融合剂，将细胞膜融合，提高融合效率。
阳性克隆筛选标准
特异性抗体检测
通过ELISA等方法检测杂交瘤细胞是否产生特异性抗体，确保阳性克隆的筛选。
抗体滴度测定
染色体鉴定
测定杂交瘤细胞培养上清中抗体的滴度，筛选出高产细胞株。
通过染色体分析确定杂交瘤细胞的染色体数目和结构，确保筛选出的阳性克隆具有稳定性和遗传性。
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克隆化培养操作规范
克隆筛选与传代
通过有限稀释法进行克隆筛选，挑选出单克隆细胞株进行扩大培养，并持续传代以保持其稳定性。
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调整细胞培养条件，如温度、湿度、气体环境等，以提高克隆形成率。
02
培养条件优化
细胞悬液制备
将杂交瘤细胞制成单细胞悬液，保证每个克隆来源于单个细胞。
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05
质量控制与检测
细胞株纯度验证
形态学鉴定
通过显微镜观察杂交瘤细胞的形态，确保细胞形态均一，无明显异常。
01
免疫学检测
采用特异性抗体对杂交瘤细胞进行免疫染色，验证其表面标志物的表达，确保细胞株的纯度。
02
分子生物学鉴定
通过PCR或基因测序等方法，检测杂交瘤细胞株的基因组或转录