第5部分生物技术与工程
专题22基因工程;考点1????重组DNA技术的基本工具;“分子缝
合针”——
DNA连接酶;知识拓展????基因工程中的同尾酶
同尾酶是指识别DNA分子中不同核苷酸序列,但能切割产生相同黏性末端的限制酶,
如图:
?
由同尾酶产生的黏性末端,能够通过碱基互补配对彼此连接,可用于基因表达载体的
构建。;易混易错????DNA连接酶和DNA聚合酶的异同;考点2基因工程的基本操作程序及应用;实验
步骤;2.PCR(聚合酶链式反应);PCR的
步骤和
结果;电泳的
定义;电泳
结果及
初步
分析;二、基因工程的基本操作程序及应用
1.目的基因的筛选与获取;2.基因表达载体的构建(基因工程的核心步骤);构建基因
表达载体
过程
示意图;限制酶
的选择;易混易错????启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比;知识拓展????(1)标记基因的常见类型及相应筛选方法;(2)对空质粒的筛选——蓝白斑筛选法:载体上携带有抗生素抗性基因及lacZ基因。
lacZ基因表达产物可分解X-gal产生蓝色物质,使菌落呈现蓝色,否则菌落为白色。该
载体上仅在lacZ基因中存在目的基因插入位点,若目的基因插入lacZ基因,则lacZ基因
失去相应功能。在大肠杆菌的培养基中加入相应抗生素和X-gal后,未导入质粒的菌
株不能生长,白色的菌落便是成功导入目的基因的大肠杆菌,呈现蓝色的菌落则是转
入空质粒的大肠杆菌。;受体细胞
的种类及
方法;知识拓展????农杆菌转化法示意图
?
(1)两次重组
①第一次重组:目的基因(①)与Ti质粒构建重组载体。
②第二次重组:重组Ti质粒上的T-DNA插入染色体DNA。
(2)两次导入
①第一次导入:将重组Ti质粒导入经Ca2+处理的农杆菌细胞。
②第二次导入:将T-DNA导入植物细胞染色体DNA上。;4.目的基因的检测与鉴定;5.基因工程的应用;考点3蛋白质工程;小表达????蛋白质工程中为什么通过对基因操作来实现对天然蛋白质的改造?????
? ???
????。;DNA复制的方向性
;转
录
和
翻
译;2.引物的特点及选择;根据扩增
目的选择
引??;3.限制酶的选择
(1)限制酶选择的原则:
①限制酶不能破坏目的基因的完整结构,也不能破坏载体上的启动子、终止子、复制
原点等必要元件;
②应使目的基因按照正确的转录方向插入载体的启动子和终止子之间;
③为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接,尽量选用不同的限制酶切割目的基
因和质粒,即双酶切。;(2)实例分析:图1质粒为载体,图2为克隆得到的含W基因的DNA片段,W基因以乙链为
转录模板链(MfeⅠ和EcoRⅠ为同尾酶,可切出相同的黏性末端)。;限制酶选择分析:图1质粒中含2个EcoRⅠ识别位点,选用EcoRⅠ会切去终止子,选用
BamHⅠ会破坏启动子,故可选用的限制酶有MfeⅠ、HindⅢ、KpnⅠ;W基因以乙链为
转录模板链,RNA聚合酶从模板链的3端开始转录,故W基因乙链的3端与启动子相连,
5端与终止子相连,为保证W基因与质粒正确连接,质粒的终止子一侧应选用与W基因
右侧相同的HindⅢ,故切割质粒可选的限制酶为MfeⅠ、HindⅢ。图2中选用MfeⅠ会
破坏W基因,故只能选择同尾酶EcoRⅠ,因此选用EcoRⅠ、HindⅢ切割图2中的
DNA。
(2020北京,17,12分)(2023新课标,6,6分);典例1????(2024朝阳一模,14)为了构建可以直接利用纤维素发酵的酿酒酵母工程菌,研
究人员构建基因表达载体(如图所示),并导入不能合成尿嘧啶的酵母菌。
下列相关分析不正确的是?(????)
A.尿嘧啶合成基因可以作为表达载体上的
标记基因
B.该方法需利用限制酶和DNA连接酶实现
目的基因与载体的连接
C.扩增目的基因时应在引物的5端添加与
线性化载体两端相同的DNA序列
D.在以纤维素为唯一碳源的液体培养基中检测酒精含量确定工程菌发酵效果;?解析????依据表达载体导入不能合成尿嘧啶的酵母菌,可知尿嘧啶合成基因可作为表
达载体上的标记基因,若导入表达载体后酵母菌能产生尿嘧啶,说明导入成功,A正确;
该方法利用载体和目的基因两侧的同源序列进行重组进而实现目的基因与载体的连
接,该方法需要使用DNA连接酶,不需要使用限制酶,B错误;PCR扩增时,子链的延伸方
向为5→3,引物的5端可被修饰,故扩增目的基因时应在引物的5端添加与线性化载体
两端相同的DNA序列,以便后续目的基因与载体的连接,C正确;在以纤维素为唯一碳
源的液体培养基中检测酒精含量,若能利用纤维素发酵且酒精含量高,则证明工程菌