第1页，共11页，星期日，2025年，2月5日实验七植物体内游离脯氨酸含量的测定第2页，共11页，星期日，2025年，2月5日实验类型：基础验证型实验学时：3学时一实验目的1.了解植物体内游离脯氨酸含量的变化，在一定程度上可以判断逆境对植物的危害程度和植物对逆境的抵抗力，也可作为植物抗旱育种、抗寒育种的一项生化指标。2.学习测定脯氨酸含量的基本原理和方法。第3页，共11页，星期日，2025年，2月5日二实验原理在正常环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量较低，但在逆境（干旱、低温、高温、盐渍等）及植物衰老时，植物体内游离脯氨酸含量可增加10~100倍，并且游离脯氨酸积累量与逆境程度、植物的抗逆性有关。因此，测定植物体内游离脯氨酸的含量，在一定程度上可以判断逆境对植物的危害程度和植物对逆境的抵抗力。采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减小了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态（干或鲜样）限制。第4页，共11页，星期日，2025年，2月5日在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，此缩合物在520nm处有最大吸收峰，可以用分光光度法测定。第5页，共11页，星期日，2025年，2月5日三主要仪器、试剂、实验材料仪器设备：分光光度计，水浴锅，试管，试剂:12.5%酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6M磷酸以3:2混合，作为溶剂进行配置，搅拌加热（低于70℃）溶解，冷却后置棕色瓶中，4℃保存可使用2~3d。2甲苯，3%磺基水杨酸溶液。3脯氨酸标准溶液：称取25mg脯氨酸，用少量80%乙醇溶解，蒸馏水定容至250mL（100μg/mL）。再取10ml用蒸馏水释定容至100ml（10μg/mL）。材料：植物叶片。第6页，共11页，星期日，2025年，2月5日四实验步骤1．脯氨酸标准曲线制作：按下表操作管号0123456标准脯氨酸/ml00.20.40.81.21.62.0H2O/ml2.01.81.61.20.80.40冰乙酸/ml22222223%磺基水杨酸/ml2222222显色液/ml4444444脯氨酸含量/μg0248121620混匀后在沸水浴加热60min，冷却，向各管加入4ml甲苯，充分震荡30S，静止片刻，以萃取红色物质，待分层后吸收甲苯层以0号管为对照在520nm下比色，作标准曲线。第7页，共11页，星期日，2025年，2月5日2样品的测定?（1）脯氨酸的提取：称取待测叶片0.5g，加5ml3%磺基水杨酸研磨，匀浆移至离心管中，在沸水浴中提取10min，（提取过程中要经常摇动），冷却后3000r/min离心10min。（2）吸取0.2ml提取液于另一干净的试管中加1.8ml，加2ml冰醋酸及4ml酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热60min，溶液即呈红色。冷却，向各管加入4ml甲苯，充分震荡，以萃取红色物质，静止待分层后吸收甲苯层以0号管为对照在520nm下比色，得吸光度值。第8页，共11页，星期日，2025年，2月5日