第1页，共40页，星期日，2025年，2月5日1荧光和荧光素利用较短波长的光(激发光)照射样品，使样品受到高能量激发，产生较长波长的荧光(发射光)，用来观察和分辨样品中产生荧光的物质的成分和位置。第2页，共40页，星期日，2025年，2月5日第3页，共40页，星期日，2025年，2月5日2常见荧光素：?（1）异硫氰酸荧光素(fluorescein?isothiocyanate,?FITC)（2）四乙基罗丹明?(rhodamine,?RB200)（3）四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl?rhodamine?isothiocynate,?TRITC)（4）镧系?（5）藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）（6）多甲藻叶绿素蛋白?（peridinin?chlorophyll?protein，PerCP）（7）碘化丙啶（?propidium?iodide，PI）第4页，共40页，星期日，2025年，2月5日第5页，共40页，星期日，2025年，2月5日第6页，共40页，星期日，2025年，2月5日3合适荧光素的选择：?具有与蛋白质形成共价键的化学基团。??荧光效率高，标记后下降不明显。?荧光色泽与背景色泽对比鲜明。??标记后能保持生物学活性和免疫活性。标记方法简单、快速。?安全无毒第7页，共40页，星期日，2025年，2月5日4荧光显微镜（fluorescencemicroscope）
荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。光源滤光片光路聚光器镜头图像采集系统第8页，共40页，星期日，2025年，2月5日荧光光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯滤色系统：激发滤色片：置于光源与物镜之间，用于选择激发光范围，只有能激发荧光染料发光的特定波长的光通过。阻挡滤色片：物镜和目镜之间，选择性通过特异的荧光，呈现专一的荧光色彩。第9页，共40页，星期日，2025年，2月5日透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进入物镜。透射荧光显微镜光路(a)落射荧光显微镜光路(b)光路第10页，共40页，星期日，2025年，2月5日5荧光显微镜标本制作要求（一）载玻片???载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。?（二）盖玻片???盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了加强激发光，也可用干涉盖玻片，这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质（如氟化镁）的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发光，这种反射的激发光女可激发标本。?（三）标本???组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。第11页，共40页，星期日，2025年，2月5日（四）封裱剂???封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l?pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。?（五）镜油???一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。第12页，共40页，星期日，2025年，2月5日6使用荧光显微镜的注意事项?（1）严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。??（2）应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯5～15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。??（3）防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。??（4）检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3～5min后，荧光也明显减弱；所以，最多不得超过2～3h。