3）洗脱液的选择在凝胶层析中流动相只是起运载工具的作用，一般不依赖于流动相性质和组成的改变来提高分辨率，改变洗脱液的主要目的是为了消除组分与固定相的吸附等相互作用，所以和其他层析方法相比，凝胶层析洗脱液的选择不那么严格。第29页，共50页，星期日，2025年，2月5日由于凝胶层析的分离机理简单以及凝胶稳定工作的pH值范围较广，所以洗脱液的选择主要取决于待分离样品，一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶层析。为了防止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液都含有一定浓度的盐。第30页，共50页，星期日，2025年，2月5日4）加样量加样要尽量快速、均匀。加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低;加样量的多少要根据具体的实验要求而定凝胶柱较大，加样量较大；样品中各组分相对分子质量差异较大，加样量也可以较大。一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1％～3％(质量分数)左右。第31页，共50页，星期日，2025年，2月5日从洗脱峰上看，如果所要各个组分的洗脱峰分得很开，为了提高效率，可以适当增加加样量；如果各个组分的洗脱峰只是刚好分开或没有完全分开，则不能再加大加样量，甚至要减小加样量。注意：样品中的不溶物必须在上样前去掉，以免污染凝胶柱。样品的黏度不能过大，否则会影响分离效果。可以首先以较小的加样量先进行一次分析，根据洗脱峰的情况来选择合适的加样量。第32页，共50页，星期日，2025年，2月5日5）洗脱速度要恒定而且合适方法：a.使用恒流泵，b.恒压重力洗脱。洗脱速度取决于柱长、凝胶种类、颗粒大小等。洗脱速度慢，样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好，但过慢会造成样品扩散加剧，区带变宽，反而会降低分辨率，而且实验时间延长。选择合适的洗脱速度，可以通过预备实验来选择。一般凝胶的流速是2～10ml／h，市售的凝胶一般会提供一个建议流速，可供参考。第33页，共50页，星期日，2025年，2月5日总之，凝胶层析的各种条件，包括凝胶类型、层析柱大小、洗脱液、上样量、洗脱速度等等，都要根据具体的实验要求来选择。第34页，共50页，星期日，2025年，2月5日如果被分离的样品中各个成分受溶液pH的影响，有时带正电荷，有时带负电荷，可用离子交换层析方法进行分离。离子交换层析的固相是离子交换体，包括离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖。二、离子交换层析适用于蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物的分离纯化。生化分离中约75%的工艺用离子交换法。第35页，共50页，星期日，2025年，2月5日第1页，共50页，星期日，2025年，2月5日凝胶过滤法又称为分子筛层析、凝胶层析或排阻层析,是利用凝胶的网状结构根据分子大小进行分离的一种方法。凝胶过滤所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的网状结构。单个凝胶珠本身象“筛子”,不同类型凝胶的筛孔的大小不同。第2页，共50页，星期日，2025年，2月5日凝胶过滤示意图第3页，共50页，星期日，2025年，2月5日凝胶过滤法的工作原理第4页，共50页，星期日，2025年，2月5日凝胶过滤层析过程示意图小分子进入葡聚糖珠内大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出凝胶基质凝胶珠带网孔的葡聚糖珠第5页，共50页，星期日，2025年，2月5日凝胶过滤的基本原理：含有尺寸大小不同分子的样品进入层析柱后，较大的分子不能通过孔道扩散进入凝胶珠体内部，较小的分子可以通过部分孔道，更小的分子可通过任意孔道扩散进入珠体内部。从而使得小分子移动最慢,中等分子次之，不同分子尺寸的分子先后顺序不同流出层析柱，达到分离的目的。第6页，共50页，星期日，2025年，2月5日1、常见凝胶种类：（1）葡聚糖凝胶：商品名称为Sephadex。市售有SephadexG10-G200。G后的数字为凝胶吸水值的10倍。G反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。（2）琼脂糖凝胶：商品名称为Sepharose或Bio-GelA，琼脂糖是从琼脂中分离制得的，这种凝胶的优点是孔径大，排阻极限高。Sepharose2B,4B,6B。（3）聚丙烯酰胺凝胶(商品名称为Bio-gelP)：SephacrylS100,S200,S300,S400。一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。注：（1）和（2）属于多糖类骨架的介质，（3）属于合成大分子骨架的介质。一、凝胶过滤介质第7页，共50页，星期日，2025年，2月5日2、凝胶介